不同浓度拟康氏木霉多糖对脐血来源DC成熟及免疫活性的影响

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目的:(1)观察不同浓度拟康氏木霉多糖对DC成熟性分化的影响;(2)观察不同浓度拟康氏木霉多糖诱导成熟的DC刺激同种异体T细胞增殖活性的影响;(3)观察不同浓度拟康氏木霉多糖诱导的成熟DC分泌细胞因子IL-12、TNF-α活性的影响。方法(:1)采集5例健康足月孕妇脐带血分离单个核细胞,在细胞因子IL-4、GM-CSF的刺激下培养未成熟DC(immature DC,imDC);(2)用不同浓度(50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml)拟康氏木霉多糖分别诱导imDC继续分化,采用流式细胞术分析不同处理的各组DC的髓系标记CD11c及其表面成熟性相关分子CD83、CD80、HLA-DR的变化;(3)采集健康成人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用尼龙毛柱分离得到纯化的T淋巴细胞作为反应细胞;将上述不同浓度的拟康氏木霉多糖诱导产生的DC作为刺激细胞,混合培养72h,MTT法检测并计算细胞刺激指数,比较组间DC刺激T淋巴细胞增殖的活性。(4)在4、8、16、24、48小时分别收集不同处理的各组DC上清液,ELISA法检测IL-12和TNF-α分泌水平的变化。结果:(1)脐血单个核细胞能在GM-CSF、IL-4诱导下分化为imDC;脂多糖(LPS)能够诱导DC成熟,其表面成熟性分子HLA-DR、CD80和CD83的表达均增加,细胞具有典型的DC形态;(2)流式细胞仪检测各组DC表型结果显示:与诱导前比较:50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml多糖组诱导的DC表面成熟性分子HLA-DR、CD80和CD83的表达均明显增高(p<0.05,p<0.05,p<0.05);与LPS诱导组比较:50μg/ml多糖组诱导的DC表面成熟性分子CD83的表达无明显变化(p>0.05);HLA-DR、CD80的表达较低(p<0.05,p<0.05)。100μg/ml多糖组诱导的DC表面成熟性分子HLA-DR、CD80的表达均无明显变化(p>0.05,p>0.05);CD83的表达明显升高(p<0.05)。200μg/ml多糖组诱导的DC表面成熟性分子HLA-DR、CD80和CD83的表达均无明显变化(p>0.05,p>0.05,p>0.05)。(3)各组诱导的成熟DC刺激T淋巴细胞增殖活性结果显示:与空白对照组比较:50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml多糖组诱导的DC刺激T细胞增殖能力均显著增强(p<0.05,p<0.05,p<0.05)。与LPS诱导组比较:100μg/ml、200μg/ml多糖组诱导的DC刺激T细胞增殖能力均无明显变化(p>0.05);50μg/ml多糖组诱导的DC刺激同种异体T细胞增殖能力较低(p<0.05)。(4)各组作用48h的DC上清IL-12、TNF-α浓度比较结果显示:与LPS组比较:100μg/ml、200μg/ml多糖组诱导的DC分泌的细胞因子IL-12、TNF-α在上清液中的浓度没有显著变化(p>0.05,p>0.05)。50μg/ml多糖组诱导的DC分泌的细胞因子IL-12、TNF-α的浓度明显较低(p<0.05)。取100μg/ml多糖组与LPS组按不同时间收集的DC上清,继续观察两组分泌的细胞因子TNF-α的时效关系。结果表明,LPS组诱导的成熟DC分泌细胞因子TNF-α时间较早,在8h左右达到顶峰;而后缓慢下降。而100μg/ml多糖组诱导的成熟DC分泌细胞因子TNF-α时间较迟,呈缓慢升高,至24h左右到达顶峰。结论:(1)拟康氏木霉多糖能刺激人脐血来源DC成熟,以浓度为100μg/ml的多糖刺激效果最为显著;(2)拟康氏木霉多糖刺激成熟的DC具有诱导同种异体的T细胞增殖的能力;(3)拟康氏木霉多糖刺激成熟的DC具有分泌细胞因子IL-12、TNF-α活性,其分泌细胞因子TNF-α的活性24h左右到达峰值,且呈时间依赖性。
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