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目的:课题组前期的实验探索证明,复方蛇龙胶囊可以明显保护阿霉素损伤肾小球足细胞,本次实验以此为基础,从细胞角度,应用分子生物学技术,以肾小球足细胞MPC5为主要研究目标,探讨关于复方蛇龙胶囊保护阿霉素损伤肾小球足细胞细胞结构和功能的作用,从蛋白层面,进一步为复方蛇龙胶囊保护足细胞及降低蛋白尿的作用机制提供理论依据。方法:1.将小鼠足细胞MPC5随机分成六组,空白对照组、模型组(阿霉素损伤足细胞)、雷公藤多苷(阳性对照组)、复方蛇龙胶囊低剂量组、复方蛇龙胶囊中剂量组、复方蛇龙胶囊高剂量组。2.CCK-8法检测各组足细胞活力。3.鬼笔环肽染色实验荧光显微镜观察足细胞骨架的形态学改变。4.Western-blot法检测每组裂孔隔膜蛋白neph1、FAT及骨架蛋白α-actimin-4的表达。5.Annexin V-FITC/PI双染染色检测各组足细胞凋亡指数。6.Western-blot方法检测各个组中足细胞线粒体中枢调节因子PGC-1α、抑凋亡因子Bcl-2、抗凋亡因子Bax及凋亡相关因子caspase3、caspase7、caspase8、caspase9、caspase12蛋白的表达结果:1.CCK-8法检测各个分组中足细胞的孵育情况,结果表示:与空白对照组比较,模型组细胞生长能力差,活力显著降低(P<0.001),模型复制成功;与模型组相比,复方蛇龙胶囊中、高剂量组细胞活力明显提高(P<0.05,P<0.01)。2.免疫荧光技术观察细胞骨架,足细胞微丝骨架呈红色,细胞核呈蓝色。空白对照组足细胞微丝骨架红色染色深,足细胞骨架结构完整,细胞密集且均匀分布,细胞微丝网络清晰且密度大;与正常组比较,模型组足细胞微丝骨架红色染色浅且颜色黯淡,足细胞骨架损伤明显,细胞数量减少且分布不均,细胞微丝网络模糊稀疏,且存在较多断裂。与模型组相比,复方蛇龙胶囊各剂量组与阳性对照组足细胞微丝骨架红色染色加深,细胞数量较多且分布均匀,细胞微丝网络清晰,微丝断裂状较少,其中高剂量组的复方蛇龙胶囊中细胞微丝骨架与阳性对照组的细胞微丝骨架染色相似。3.Western blot检测后表现为,与空白对照组相比,模型组neph1、FAT的蛋白表达显著降低(P<0.01),α-肌动蛋白-4蛋白表达显著增加(P<0.05),差异具有统计学意义,说明阿霉素损伤足细胞模型复制成功;与模型组相比,阳性对照组和高剂量组复方蛇龙胶囊中neph1、FAT蛋白表达升高(P<0.05),复方蛇龙高剂量组的α-肌动蛋白-4蛋白表达极其显著降低(P<0.001),差异具有统计学意义;与阳性对照组比,复方蛇龙胶囊高剂量组α-肌动蛋白-4蛋白表达显著降低(P<0.01),复方蛇龙胶囊中剂量组α-肌动蛋白-4蛋白表达降低(P<0.05),差异具有统计学意义。4.Annexin V-FITC/PI双染法检测凋亡后显示,与空白对照组相比,模型组凋亡率显著上升(P<0.001),阿霉素损伤足细胞模型复制成功;与模型组相比,复方蛇龙胶囊中、高剂量组与阳性对照组的凋亡率显著降低(P<0.001),复方蛇龙胶囊低剂量组凋亡率明显降低(P<0.01)。5.蛋白印迹法(Western-blot)检测结果表示,与空白对照组比较,模型组PGC-1α、Bcl-2蛋白表达极其显著降低(P<0.001),Bax、caspase3-17kD、caspase7、caspase8的53kD和34kD、caspase9-35kD、caspase12蛋白的表达情况极其显著升高(P<0.001),caspase8-57kD蛋白的表达升高(P<0.05);复方蛇龙胶囊高剂量组与模型组相比,PGC-1α、Bcl-2蛋白的表达极其显著升高(P<0.001),Bax、caspase7、caspase8-53kD、caspase9-35kD蛋白的表达极其显著降低(P<0.001),caspase3-17kD、caspase8-34kD、caspase12蛋白的表达显著降低(P<0.01),casebase8-57kD蛋白的表达降低(P<0.05),与阳性组相比,复方蛇龙胶囊高剂量组caspase7、caspase9-35kD的蛋白表达极其显著降低(P<0.001);复方蛇龙胶囊中剂量组Bcl-2蛋白的表达升高(P<0.05);复方蛇龙胶囊低剂量组caspase8-53kD蛋白的表达极其显著降低(P<0.001),caspase9-35kD蛋白的表达降低(P<0.05)。结论:1.复方蛇龙胶囊可以有效的增加阿霉素损伤肾小球足细胞的细胞活力,降低其凋亡率。2.复方蛇龙胶囊对阿霉素损伤足细胞的细胞骨架有保护作用。3.复方蛇龙胶囊可能通过上调具有足细胞保护作用的裂孔隔膜蛋白neph1、FAT的表达,下调肌动蛋白细胞骨架α-actinin-4蛋白表达,修复裂孔隔膜和细胞骨架,从而保护足细胞的正常功能。4.复方蛇龙胶囊可能通过上调线粒体中枢调节因子PGC-1α、抑凋亡因子Bcl-2,下调促凋亡因子Bax、凋亡效应型因子caspase3、caspase7、凋亡起始型因子caspase8、9,炎症介质caspase12蛋白的表达,从保护线粒体出发,阻止Bcl-2家族及caspase家族的凋亡因子激活,从而延缓细胞凋亡,保护足细胞的正常功能。