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鰤诺卡氏菌病是海水和淡水鱼类中流行一种慢性传染病,给水产行业带来严重危害,病原菌为鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)。该病原菌能够引起机会性感染,当生存环境恶劣,鱼体自身免疫功能不全,生长情况差或者鱼体存在伤处和缺陷时,通过创伤或者饲料喂养等媒介均可以感染鰤诺卡氏菌,引起一种急性或慢性化脓或肉芽肿性病变,主要症状是肝脏、肾脏和脾脏处有明显肉眼可观察到的结节(肉芽肿),心和鳔上偶尔也可见。mce1A基因编码的细胞侵袭相关蛋白是结合分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的毒力蛋白之一,隶属哺乳动物细胞入侵因子蛋白家族,决定结核分枝杆菌侵袭性表型。本文以22株不同鱼源的致病性鰤诺卡氏菌为研究目标,针对鰤诺卡氏菌的哺乳动物细胞入侵因子蛋白进行生物学分析,并对其中mce1A基因进行克隆及表达分析,以期了解mce1A基因在鰤诺卡氏菌致病机制中的作用。本文采用荧光定量PCR检测鰤诺卡氏菌在卵形鲳鲹内的菌载量动态变化。在急性感染阶段,被检测组织中均发现鰤诺卡氏菌存在,表明可以在不同组织内定植,分布广泛。其中,肾组织中的菌载量最高,揭示肾组织是鰤诺卡氏菌侵染的最适靶组织。根据皮疽诺卡氏菌(N.farcinica)、盖尔森基兴奴卡氏菌(N.cyriacigeorgica)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、新星诺卡氏菌(N.nova)mce1A基因的核酸序列,在保守区域设计一系列特异性mce引物,应用聚合酶链式反应扩增特异性片段,结果发现24种哺乳动物细胞入侵因子在提供的22株鰤诺卡氏菌中均有存在,表明MCE家族蛋白在鰤诺卡氏菌保存了其完整性。应用克隆等生物学技术确定鰤诺卡氏菌mce1A全长1254 bp,编码417个氨基酸,DNAstar预测该基因编码蛋白质的大小约为43.98 kD,理论等电点5.14,含有161个疏水性氨基酸,疏水性平均值为0.044,为疏水性蛋白。经PHD,DSC,MLRC和Sec.Cons分析发现MCE1A具有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲三种二级结构。经http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?SEQUENCE=749292827&FULL预测,MCE1A有MCE,DUF3407 domain,OM_asym_MlaD,Mtu_fam_mce,MlaD 5个结构域,其中MCE和Mtu_fam_mce结构域在蛋白上位置存在重叠区,推测重叠区是蛋白发挥功能的主要区域,是毒力产生的主要区域,而34-160之间的蛋白可能参与入侵巨噬细胞并在其内存活繁殖相关活动。OM_asym_MlaD和MlaD共同组成ABC转运蛋白参与脂类的运输。其N-末端有强疏水片段,折叠修饰后,通过软脂酸链与一端半胱氨酸残基结合而锚定到膜上,推测其为信号肽序列。分析鰤诺卡氏菌与其他16个物种该序列的同源性发现,其与鰤诺卡氏菌的同源性最高(100%),与Amycolicicoccus subflavu的最低(<20%),值得注意的是鰤诺卡氏菌MCE1A氨基酸序列和同属的南非诺卡氏菌同源性仅为11.7%,造成这种现象的原因是鰤诺卡氏菌感染宿主为水生动物,南非诺卡氏菌感染宿主为哺乳动物,两者感染宿主差异较大,造成在进化过程中出现分枝。根据MCE1A氨基酸序列构建的系统进化树发现鰤诺卡氏菌和新星诺卡氏菌的亲缘关系最近。构建了pET32a-mce1A重组质粒并转化至大肠埃希菌BL21中,诱导表达后得到的重组蛋白的相对分子量约63 kD,为进一步研究MCE1A的功能奠定基础。制备pET 32a(+)-mce1A抗原蛋白并进行乳化,腹腔注射卵形鲳鲹。免疫期间实验鱼体表和口唇处出现溃疡,全身性小红点等症状,解剖后其内脏组织没有发现任何异常,内脏组织接种划线未发现细菌感染。免疫30d后进行鰤诺卡氏菌攻毒实验检测MCE1A重组蛋白的免疫保护力,结果发现免疫组实验鱼死亡率高达60%甚至100%。但是空白组和PBS的存活率明显高于三个免疫保护实验组。鰤诺卡氏菌索状因子是一种糖脂类毒力因子,可以使健康的卵形鲳鲹产生肉芽肿病变。本文提取鰤诺卡氏菌索状因子并对其乳化免疫健康卵形鲳鲹,结果显示两次免疫保护效果未达到预期免疫保护效果,免疫组最高存活率为50%。该研究为研制诺卡氏菌疫苗奠定了基础,提供一种可能。