论文部分内容阅读
第一部分脑动静脉畸形栓塞治疗后的组织病理及免疫组化研究目的分析人脑动静脉畸形（CAVM）栓塞治疗后的组织病理变化。方法对11例行血管内栓塞治疗术后再作手术切除的CAVM的病理资料进行分析，并应用增殖细胞核抗原（PCNA）、骨桥蛋白（OPN）、α—平滑肌肌动蛋白（α—SMA）、血管内皮生长因子（VEGF）等单克隆抗体进行免疫组织化学分析。结果栓塞治疗后，CAVM血管腔内出现不同程度的血管内、外的炎性反应。表现为管壁及管周的淋巴细胞浸润、管腔内的内膜增生和异物巨细胞聚集等。部分被栓塞的血管腔内出现血管再通；免疫组化分析表明，新生内膜中SMA阳性染色，表明血管平滑肌细胞（VSMC）参与新生内膜的形成；OPN在新生内膜及异物巨细胞中有强阳性表达；畸形血管团周围组织中发现异常微血管，其内皮细胞PCNA阳性染色率高，并且VEGF呈阳性染色，表明有活跃的血管生成。栓塞治疗后，畸形血管周围组织中血管内皮细胞的增殖指数（19.6±8.4，％）高于作为对照组的出血性CAVM患者（10.1±6.2，％），差异有显著性意义（P＜0.05）。结论栓塞材料引起血管不同程度的炎性反应，适度的血管反应有助于管腔的闭塞；栓塞的血管部分有再通现象；栓塞治疗后畸形血管团周边有微血管增生迹象。第二部分脑动静脉畸形伽玛刀治疗后的组织病理及免疫组化研究目的立体定向伽玛刀放射治疗是目前CAVM的主要治疗手段之一。本实验旨在研究CAVM伽玛刀治疗术后的组织病理变化，并分析VSMC的增殖及迁移等功能活动在相关病理变化中的意义。方法对经伽玛刀治疗的5例CAVM患者的病理标本采用HE染色，并用α—平滑肌肌动蛋白（SMA）、增殖细胞核抗原（PCNA）、骨桥蛋白（OPN）及血管内皮生长因子（VEGF）等抗体进行免疫组化研究，其中1例作透射电镜检查。结果CAVM在伽玛刀治疗术后进行性的血管病理变化包括内皮细胞损伤、内膜增厚，管壁增厚，管腔狭窄。继之管壁玻璃样变，管腔逐渐消失。玻璃样变的管壁或闭塞的管腔可以出现管腔再通。OPN、PCNA在表现为早期放射反应的动脉管壁中有强表达，在晚期放射反应的血管中表达消失；电镜检查发现，内皮细胞损伤脱落，内弹力层分层或者断裂，血管平滑肌细胞分布不规则。内膜下、血管中膜及外膜大量胶原沉着为电镜检查的特征；1例标本见内皮细胞PCNA及VEGF阳性染色的网状毛细血管样血管。结论放射治疗后CAVM血管中层的VSMC增生，部分转变为合成表型。VSMC的迁移、增生是伽玛刀治疗后管腔进行性狭窄的关键因素。第三部分骨桥蛋白在脑动静脉畸形中的表达及意义目的：骨桥蛋白（OPN）的表达是合成型血管平滑肌细胞的标志，也是血管主要细胞成分的重要趋化因子和黏附分子，在病理性血管重塑过程中起重要作用。本研究旨在探讨OPN在人脑动静脉畸形（CAVM）血管组织及其在立体定向伽玛刀放射、血管内栓塞治疗后的表达情况并探讨其意义。方法：42例（其中5例经过伽玛刀放射治疗，11例经历过血管内栓塞治疗）手术切除的CAVM病理标本进行HE及免疫组化染色分析，并检测畸形血管中OPN的表达情况。结果：26例无术前治疗史的畸形血管组织中22例OPN有不同程度的表达，主要表达在CAVM的静脉部分，尤多见于管壁不规则增厚的静脉。在类似粥样硬化样的动脉处也有表达。正常脑组织的血管中未见有OPN的表达，表明CAVM血管中有部分VSMC转变为合成表型。按有无出血史及畸形血管团大小分组进行对比分析，未发现组间有显著性差异；经历伽玛刀治疗的5例中，2例在早期及中期放射反应的动脉中可见OPN的较强阳性表达。在经历栓塞治疗的11例中，7例在新生内膜组织或者异物巨细胞中见到OPN的阳性表达。结论：OPN在人CAVM血管组织中多有表达，这是CAVM的血管适应血流动力学状态而具有的血管重塑的特征性表现。在放射、血管内栓塞治疗后的血管组织中的表达提示它对血管重塑可能发挥重要作用。第四部分脑动静脉畸形血管平滑肌细胞的培养和鉴定目的：VSMC是血管壁最主要的细胞成分，其生物学行为与CAVM的病理状态关系密切。本研究旨在建立一个稳定的人CAVM血管平滑肌细胞的培养体系，以作为体外研究的细胞学模型。方法：取手术切除的人CAVM组织块用胶原酶消化法接种于铺有胶原底层的培养瓶中进行原代及传代培养，并对其进行形态学观察、免疫组化染色及透射电镜等一系列细胞定性研究。结果：接种后6-8d后可见即可见少量细胞贴壁，原代培养的细胞呈长梭形，具有“峰”、“谷”样生长特征；免疫组化显示95％以上的细胞为SMA阳性染色，而CD34阴性染色；透射电镜检查发现培养的细胞具有肌丝及密斑等结构。从不同角度鉴定了所获细胞具有CAVM的特征，而且细胞纯度较高。细胞可以连续传代。结论：应用酶消化法可获得纯化的血管平滑肌细胞，细胞可以连续传代培养。体外CAVM的血管平滑肌细胞可作为细胞学模型用于深入研究。第五部分不同培养条件对体外脑动静脉畸形VSMC增殖和迁移的影响目的研究不同培养条件对体外CAVM的血管VSMC增殖、迁移的影响。方法应用细胞计数绘制生长曲线、MTT法检测碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对体外培养的人CAVM的VSMC增殖的影响，并应用用逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫印迹的方法分别检测它对VSMC表达骨桥蛋白（OPN）基因和蛋白的影响；用细胞迁移模型观察骨桥蛋白对VSMC迁移能力的影响。结果：细胞计数分析表明，bFGF作用于VSMC后，细胞增殖明显加速。MTT法显示细胞增殖活性显著高于未添加bFGF的对照组（P＜0.05），RT-PCR半定量分析结果显示，bFGF实验组的OPN／β-actin（0.39±0.069）与对照组（0.24±0.049）相比有显著性差异（P＜0.05）；免疫印迹半定量分析显示实验组和对照组的OPN蛋白条带的OD值分别为267.91±22.16和171.735±29.77，差异有显著性意义（p＜0.01）；体外迁移实验中，骨桥蛋白实验组的迁移距离（298.6±23.92 um）和对照组的迁移距离（164.1±20.1 um）有显著性差异（P＜0.05）。结论处于活跃增殖状态下的VSMC有OPN的表达，外源性的骨桥蛋白可以促进CAVM的VSMC迁移，体外条件下，bFGF可以刺激培养的人CAVM的VSMC增殖，并能促进OPN的表达。4