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随着传统抗生素的广泛使用，关于药物残留和菌株耐药性等问题的争论日益激烈。研究与开发更为有效，同时对人、动物及环境安全无害的传统抗生素替代品是当今科研领域的研究热点之一。抗菌肽由于具有有效的抗菌活性及独特的抗菌机制，在替代传统抗生素方面显示了巨大潜力。牛乳铁蛋白肽(BovineLactoferricin，LfcinB)及其衍生肽具有高效广谱抗菌等多种生物学功能。其衍生肽LfcinB15-W4,10是由15个氨基酸残基组成的阳离子型抗菌肽，由于氨基酸序列的优化，其功能活性较LfcinB有所提高，且本身不含稀有氨基酸和外源化学成分，所以是一种极具应用潜力的健康安全的抗菌替代物。本研究比较了LfcinB15-W4,10和常用抗生素的体外抑菌活性，通过基因工程技术表达LfcinB15-W4,10，为大规模生产LfcinB15-W4,10奠定了理论与实践基础。本研究主要结论如下：
在体外抑菌实验中，化学合成LfcinB15-W4,10的总体抑菌效果比青霉素、金霉素、链霉素、多西环素稍差，但是仍然对测试菌株表现出较强的抑菌活性。根据LfcinB15-W4,10氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性设计合成编码基因，设计非对称粘性末端5-CCGA/5-TCGG，在T4DNA连接酶作用下首尾串联成多聚体编码序列。分别设计含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的接头，将多聚体编码基因定向插入表达载体pET32a，构建重组表达载体pET32a-(LfcinB15-W4,10)n。经菌落PCR和DNA测序验证后得到含有单拷贝至七拷贝和九拷贝编码基因的转化子。IPTG诱导表达，蛋白质电泳分析结果表明不同拷贝数的多聚体融合蛋白得到特异性诱导表达，其中四聚体融合蛋白表达水平最高，占菌体总蛋白的45％。经Ni2+亲和层析柱纯化回收四聚体融合蛋白，纯度达到86.3％以上，每1升细菌培养物可得到约73mg融合蛋白。按照每毫克四聚体融合蛋白加入5单位凝血酶进行裂解，在25℃保温48h可实现完全裂解，经电洗脱回收得到纯度在99％以上的LfcinB15-W4,10四聚体。利用薄层琼脂扩散法检测重组LfcinB15-W4,10四聚体抑菌活性，对金黄色葡萄球菌ATCC25923具有明显的抑制作用。经微量肉汤稀释法测定其对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)为16μg/mL。
本实验成功实现了抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽LfcinB15-W4,10在大肠杆菌BL21(DE3)中的串联融合表达，平均每升细菌培养物最终可以获得10mg纯度99％以上的具有抑菌活性的重组LfcinB15-W4,10四聚体，为基因工程方法生产LfcinB15-W4,10及其它抗菌肽奠定了理论与实践基础。