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背景和目的:
目前，由于同种器官的匮乏，器官移植的数量受到了限制，异种移植是器官移植的重要研究方向之一。猪作为供体在器官大小、生理学行为等方面与人类较为接近，以及有易于获得、容易繁殖、可以进行基因改造等方面的优势，因此迄今为止，猪被认为是最适合人类的异种移植供体；但是异种抗原之间存在巨大的差异，宿主会对异种移植物产生强烈的排斥反应<1，2>。虽然免疫抑制疗法取得了重要的进展，减少了同种移植的急性排斥反应，并改善了移植患者的短期预后，但是移植患者的长期预后并没有得到改善<[3]>。免疫抑制疗法不能预防异种移植的排斥反应，而且增加了受体发生感染的风险。因此，越来越多的学者认为介导供体特异性免疫耐受是异种移植避免排斥反应和减少免疫抑制疗法并发症的唯一方法<[4]>。
已有研究证实骨髓移植所建立的造血嵌合体，可以在龋齿类动物<[5-8]>、猪<[9]>、非人类灵长类动物<[10-12]>及人同种器官移植<[13,14]>中介导供体特异性免疫耐受；如果能够建立造血干细胞嵌合体，则嵌合体可以介导受体对来自干细胞同一供体的组织或器官的免疫耐受<[15，16]>，但是由于缺乏合适的动物模型，尚不知道嵌合体是否能介导人T细胞对猪异种抗原的免疫耐受<[15]>。通过移植人胎儿的胸腺及肝脏组织从而在实验鼠外周血中可测得人T细胞，通过移植胎儿骨髓获得可测定的B细胞标记物<[17-19]>。Lan等的研究证实，通过共移植人胚胎胸腺、肝脏和CD34<+>干细胞到NOD/SCID鼠，可以在NOD/SCID鼠体内重建有功能的人免疫系统<[20]>。迄今尚未证实猪造血干细胞能否诱导人受体对猪供体抗原的免疫耐受，此实验不可能在人体直接实施，由此需要一个中介性的载体可以建立完整的人细胞免疫及体液免疫功能，同时在此载体中猪造血干细胞能够长期存活。有研究证实人胎肝脏单核细胞包含很多造血干细胞，包括CD34<+>、CD34<->的造血干细胞，所以在本研究中用人胎肝脏单核细胞替代CD34<+>的造血干细胞<[21-23]>，以保留更多的造血干细胞。本研究通过共移植猪骨髓细胞、人胎胸腺/肝脏组织块及胎肝单核细胞悬液于NOD/SCID鼠体内以期建立全面的人细胞及体液免疫功能的动物模型，并建立稳定的猪/人/鼠嵌合体，同时诱导人T细胞对猪异种抗原的特异性免疫耐受。
材料方法:将猪麻醉(3﹪戊巴比妥30mg/Kg)<[24]>成功后，无菌条件下取10块猪脊椎骨，用咬骨钳将猪椎骨咬碎后，放入盛有200ml RPMI1640培养液(含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)的500ml广口瓶中，将瓶子放在震动器上震动45min，用100目滤网过滤；过滤液1800rpm离心，5min，弃上清；重悬沉淀，再次过滤，重复两遍；将最后一次离心的沉淀重悬后，加入含Ficoll液的离心管中离心，取单核细胞层；将单核细胞用PBS洗涤，配制成所需浓度备用，整个过程均为无菌操作。
获得21周龄人胚胎后，取出胚胎胸腺及肝脏，将胚胎胸腺/肝脏置于冰上，剪至0.1-0.2cm大小组织块。将剩余肝脏置于滤网中用玻璃棒研磨，并用RPMI1640培养液(含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)冲洗，用100目滤网过滤后，1800rpm离心，5min，弃去上清；重悬沉淀，再次过滤，重复两遍；将最后一次离心的沉淀重悬后，加入Ficoll液中离心，取单个核细胞层；将单个核细胞用PBS洗涤后，配制成所需浓度备用，整个过程均为无菌操作。
取己饲养在层流箱内的SPF级NOD/SCID鼠，置于表面多孔有机塑料盒内，接受<60>Coγ射线WBI 3Gy后<[25]>，6h内经实验尾静脉输注猪BMCs 1.0×10<8>细胞悬液1ml；3天后将21周大小的人胎儿胸腺及肝脏组织块(0-1-0.2cm)，移植于裸鼠右侧肾包膜下，同时经尾静脉输注人胎肝单核细胞悬液1ml(浓度为1.0×10<8>/ml)移植猪骨髓及人胚胎组织后，每3周取鼠外周血制备受体NOD/SCID鼠外周血的白细胞悬液，以流式细胞仪测定嵌合细胞含量，以判断猪和人的嵌合体水平；并通过混和淋巴细胞反应确定人T细胞是否对供体猪抗原产生免疫耐受<[26]>，用Ficoll液制备猪pBMT+Thy/Liv/MNCs移植组实验鼠肝脏/胸腺移植物单核细胞悬液作为反应细胞，分别用经过30Gy照射过的骨髓供体猪外周血单核细胞、SLA不相合的第三种猪外周血单核细胞以及人的外周血单核细胞作为刺激因子，以加经过30Gy照射的供体胚胎肝脏单核细胞作为刺激因子的反应细胞管作为对照组并用氚化胸腺嘧啶([<3>H]thymidine)作为标记物加入培养基中，在培养后的第四天，用Tomtec细胞自动收集器收集细胞，并用液体闪烁分析仪测定氚化胸腺嘧啶的标记水平，以确定T细胞的增殖程度。
结论:1、猪骨髓细胞移植于NOD/SCID鼠后能产生长期稳定的猪嵌合体。
2、通过人胎胸腺/肝脏组织块及胎肝单核细胞悬液的共移植能建立表达人细胞及体液免疫功能的动物模型。
3、通过共移植猪骨髓细胞、人胎胸腺/肝脏组织块及胎肝单核细胞悬液可以建立猪/人/鼠嵌合体。
4、通过造血干细胞嵌合体可以诱导人T细胞对猪异种抗原的免疫耐受。