论文部分内容阅读
本文分两个部分进行探讨： 第一部分：多模式报告基因监测移植干细胞治疗的基础研究 目的：利用腺病毒作为载体将TGF转导入骨髓基质干细胞（bone marrow stem cells,BMSC）,研究该基因在BMSC内的表达以及活体动物显像，探索TGF作为融合报告基因监测移植干细胞治疗的可行性。 方法：构建多模式报告基因TGF的腺病毒载体Ad5-TGF。以不同感染复数的AD5-TGF感染BMSC后，荧光显微镜下观察绿色荧光细胞阳性率；MTT比色法检测感染细胞活力；分别采用PCR和western blot从mRNA水平、蛋白表达水平鉴定HSV1-tk、eGFP和Fluc的表达。分别进行了核素探针制备了18F-FHBG和131I-FIAU的制备，并研究了不同感染复数的AD5-TGF感染BMSC后对报告探针131I-FIAU的摄取情况。种植感染AD5-TGF后的BMSC于SD大鼠的左侧前臂，随后进行了自体荧光成像、生物发光成像、SPECT成像和MicroPET成像，来进行TGF用于活体动物显像的初步研究。 结果：重组腺病毒MOI=100可高效感染BMSC，在荧光显微镜下绿色荧光细胞阳性率可达70％，MTT结果显示病毒对BMSC的活性无明显影响。PCR技术在Ad5-TGF感染的BMSC内扩增出HSV1-tk、eGFP、Fluc的mRNA片段；Western-blot印迹分析显示进一步从蛋白水平证明TGF在腺病毒载体介导下能够正确表达；131I-FIAU的摄取研究表明，携带TGF的腺病毒载体转导BMSC后，对131I-FIAU有较高的摄取，在观察期内摄取率随时间而升高；在SD大鼠左前上肢注射经Ad5-TGF转染BMSC位置，我们分别可以通过小动物活体荧光、小动物生物发光及Micro-PET三种不同的显像方式获得图像。 结论：TGF可以作为一种多模式的报告基因用于监测移植干细胞治疗。 第二部分：心肌梗死鼠模型干细胞移植治疗的多模式分子影像活体监测 目的：构建含有HSV1-tk、eGFP和Fluc的多功能质粒（TGF）为报告基因，探索这一新型报告基因转染至骨髓间充质干细胞后，应用PET、荧光及生物发光多模式分子影像活体监测急性心肌梗死大鼠模型移植骨髓间充质干细胞（rBMSCs）治疗的可行性。 方法：通过基因融合的方式构建TGF，并应用腺病毒包装制备Ad5-TGF，将其转染至大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）。结扎大鼠冠状动脉建立急性心肌梗死模型，采用MOI=100的Ad5-TGF体外转染rBMSCs（3×106cell），随后移植到大鼠心肌梗死模型的左心室下壁心肌内，并以移植未转染Ad-TGF的rBMSCs作为正常对照组（n=5）。分别采用MicroPET/CT成像（18F-FHBG）、自体荧光成像和生物发光成像三种显像方式连续1周（第2、3和7天）进行活体移植干细胞监测。显像应用不同模式进行局部信息半定量分析。完成显像研究后的大鼠取出心肌组织，应用PCR、组织学和免疫组织化学分析局部报告基因TGF的表达情况。 结果：成功构建TGF质粒，并应用腺病毒包装得到重组腺病毒Ad5-TGF1.26×1010TU/mL。将Ad5-TGF转染至rBMSCs后，移植至大鼠心梗模型的左心室心肌部位后1周内，应用microPET/CT、自体荧光成像和生物发光成像三种显像均可清晰见到移植细胞局部的基因表达显影，获得特异性影像；而移植未转染Ad-TGF的正常rBMSCs的大鼠心梗模型的心脏部位未见明显影像。采用三种显像模式对移植rBMSCs的心梗模型大鼠进行了1周的连续监测，其2天、3天和7天的心脏区域的18F-FHBG摄取分别为0.341±0.136，0.241±0.112和0.101±0.082 injected dose/g；心脏部位的荧光强度分别为582±107，512±71和221±85 fluorescence units；心脏区域的光信号分别为:3.556±0.725,2.731±0.652和0.962±0.326×106 photons/s/cm2/sr.上述提示应用三种显像模式可以持续观察干细胞在心梗组织局部移植后至7天，但是随移植后时间延长，局部信号逐渐减弱。应用PCR、组织学和免疫组织化学均证实局部移植组织有TGF的表达。 结论：本部分研究首次应用转染TGF的rBMSCs移植至在急性心肌梗死模型后，通过MicroPET/CT、荧光成像和生物发光多模态显像对rBMSCs进行在体动态监测，并提示TGF可以作为一种多模式的报告基因用于活体监测移植BMSCs治疗缺血性心脏疾病。