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利用微生物二元发酵来提高发酵产物的产量或者获得全新的发酵产物是微生物工作者关注的热点话题。而研究微生物之间的相互作用无疑有利于促进二元发酵在现代发酵工业生产中的应用。本文中,在一个有趣的发现启示下,一个单独培养时均不产色素,混合培养时却有大量红色素产生的P-Y二元系统模型被成功构建,利用该模型,我们对微生物之间的相互作用进行了一系列的探索。通过微生物筛选、分离及鉴定、红色素发酵工艺条件优化、红色素的二元发酵过程的放大、红色素的提取及纯化、色素的基本性质及结构研究等一系列工作,从不同角度阐明了红色素过量表达的原因。并且将探索发现的微生物二元发酵的机理进一步应用到漆酶、纤维素酶及淀粉酶的发酵过程中去。通过以上探索,希望能为人们理解微生物间有趣的相互作用提供一些有用的信息,为微生物二元发酵在现代发酵工业中的应用积累一些浅显的科研经验。下面将本研究的主要结果简述如下:
首先,建立了由青霉和酵母组成的红色素二元发酵模型(P-Y模型)。对偶然发现的,混合培养时能产大量红色素的青霉及酵母菌进行了鉴定。经分离和纯化后,形态学,生理生化性质以及分子生物学的鉴定结果表明:酵母属假丝酵母(Candida sp.),青霉为新西兰青霉(Penicillium novae-zeelandiae)。此外,研究发现产红色素的主体菌是青霉HSD07B,而酵母HSD07A的出现则是红色素产生的诱因。在此基础上,建立由青霉和酵母组成的二元发酵模型,从而为探讨微生物间的相互作用提供了一个良好的研究对象。
其次,对二元发酵红色素的工艺及发酵条件进行了优化。利用P-Y系统二元发酵生产红色素,根据色素产量的大小,确定其最佳发酵工艺。并在三角瓶中对pH、温度、接种量、接种时间、转速等发酵参数进行优化。此外,利用21、51、121及501发酵罐对红色素的二元发酵过程进行逐级放大。结果发现,液体发酵工艺应是红色素二元发酵的首选工艺。液体发酵的最佳发酵条件是:马铃薯葡萄糖液体发酵培养基,温度29℃,转速150 rpm,培养基初始pH5.0,酵母青霉总接种量10％,接种比例为1:1,青霉菌HSD07B培养6 h时再接种酵母HSD07A。红色素二元发酵经2.501等一系列发酵罐放大后,产量最高可达7.9g/l。生产的红色素经提取后,为色素成分的进一步分离和鉴定提供了必需的样品。
第三,从不同角度探讨了二元系统产生红色素的机制。以P-Y二元系统作为研究模型,从水解酶攻击、细胞接触、底物诱导、营养限制等不同角度探讨其红色素的产生机制,借以考察微生物间的相互作用关系。结果发现:水解酶攻击,细胞接触及底物诱导均不能导致红色素的产生；葡萄糖浓度是影响红色素是否产生的关键因素。较高的葡萄糖浓度抑制红色素的产生,而在葡萄糖饥饿条件下,红色素却能大量产生。利用核磁共振、红外光谱、气相色谱等技术研究酵母菌制造葡萄糖饥饿的细节发现,酵母把葡萄糖主要转化为甘油,此外,产生少量乙醇及一些有机酸。
第四,建立了红色素的提取方法并对其组份进行了分析。通过优化红色素的提取工艺,得到红色素样品。研究其溶解性,稳定性及生理功能。结果表明青霉红色素易溶于水,乙醇和丙酮,部分能溶于乙酸乙酯,不溶于乙醚,石油醚等小极性或非极性溶剂。此外,其性质稳定,无抑菌性,并且能被青霉作为唯一碳源,却不能被酵母利用,因此是青霉的专用碳源和能源。经薄层色谱分析,发现红色素乙醇及水溶液中至少含有4种组分:A,B,C及D。但二元发酵所得红色素乙醇溶液与单发酵青霉红色素乙醇溶液中的成分并不完全相同,其中红色素B在二元发酵产生的红色素中出现,而在单发酵青霉红色素中却没有。将红色素B采用柱层析法初步分离,而后再利用硅胶板TLC纯化,纯化的B带经核磁共振波谱分析,发现在3.4-3.8 ppm之间,有明显的甘油基团,因此推断青霉HSD07B能以发酵液中酵母产生的甘油为前体,合成自己专用的红色素B。
最后,将二元系统发酵红色素的机理应用到一些酶制剂的发酵中。利用酵母+其他丝状真菌进行漆酶、MnP、淀粉酶及纤维素酶的发酵,并对发酵效果进行评估,考察所了解到的二元发酵机制是否能够在酶制剂的生产中得到应用。结果发现:二元系统在漆酶、淀粉酶及纤维素酶的液体发酵过程中,均能表现出优于单菌发酵的优势,三种酶的活力均不同水平的得到提高,其中,漆酶的提高幅度最大。但是,在MnP发酵过程中,加入酵母不但不能提高MnP的产量,反而会导致其酶活力大幅度下降。