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胶类中药是动物类中药的重要组成,其中阿胶(Colla Corii Asini,CCA)的生产规模和市场销量都处于领先。CCA的药理作用主要为改善代谢平衡、滋阴补血和调节免疫功能。CCA中的生物大分子主要为蛋白质和糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG),目前对于CCA的研究还不够全面,因此本论文的第一个目标是研究CCA中生物大分子的结构,研究皮样和胶样中蛋白及糖胺聚糖的组成,建立相关的质谱分析方法。GAG与蛋白的相互作用在生物体内发挥重要功能。在CCA研究中我们对蛋白序列和GAG糖单元进行了分析,但GAG和蛋白的相互作用研究需要更复杂的质谱分析方法和其它新的技术。通过CCA建立的质谱分析方法可对蛋白和GAG进行初步的分析,而对于复杂的糖蛋白混合物的序列长度、糖基化种类、糖链、糖基化位点的定性及定量还需要在其基础上进一步的方法开发。因此本文的剩余篇幅聚焦于复杂度更高的糖蛋白异型体的分析方法开发以及结合生物膜干涉技术(Bio-layer Interferometry,BLI)和亲和柱技术的GAG与趋化因子的相互作用研究。GAG与趋化因子的相互作用与多种生理病理过程相关,我们选择趋化因子5(Chemokine ligand 5,CCL5)作为模式分子建立相关分析方法。CCL5是趋化因子家族的一种。趋化因子是指一些低分子量(6-14kDa)的碱性蛋白,因其定向趋化吸引白细胞迁移到感染部位而在炎症反应中具有重要作用。CCL5又称调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(Regulated on activation normal T cell expressed and secreted,RANTES),从属于CC类趋化因子亚族(β类趋化因子)。CCL5与其受体结合,可以抑制HIV病毒进入细胞。但是由于CCL5同样影响炎症作用,因此药物设计一般希望通过调控CCL5的修饰改变炎性作用,并且不影响其抑制病毒进入的作用。CCL5与GAG的结合,是CCL5形成趋化因子梯度,发挥趋化性质的先决条件,同时也是CCL5与受体发生相互作用的前提。因此,对CCL5与GAG相互作用的研究具有重要意义。我们首先建立质谱分析方法了解人体内天然CCL5的结构及组成,然后合成15种不同截短型与糖基化修饰的CCL5异型体,开发相应的定性及定量质谱分析方法,最后应用此分析方法研究不同CCL5与GAG在不同情况下的相互作用,探究并解释相互作用的机理。本论文的主要研究成果如下:1.建立了一种CCA来源鉴定的方法对CCA的主要蛋白进行分析,并建立了 CCA来源鉴定的方法。通过鸟枪法蛋白组学研究不同物种驴马牛猪的皮样蛋白,确定主要蛋白为胶原蛋白,通过羟基化修饰搜索对应物种的数据库,发现胶原蛋白是严重羟基化的。选择主要成分胶原蛋白作为研究对象,通过生物信息学比较不同物种的I型胶原蛋白序列,以推测每种物种理论的特征序列。对皮样的酶解样品进行质谱分析,提取理论特征序列的母离子,根据筛选条件确定每个物种的特征肽,并在胶样样品中提取到了对应的特征肽,从而确证特征肽的可行性。合成对应的特征肽并建立对应特征肽检测的多反应监测(Multiple Reaction Monitoring,MRM)方法,提高了方法灵敏度,并通过分析掺假样品和商品CCA进行了方法确证及应用。最终通过此方法可以检测到掺假0.5%的CCA,并且可以使用此方法特异性地区分驴、马和杂交物种骡子,从而排除其掺假的可能性。2.分析了驴皮降解过程中糖胺聚糖的变化将驴皮和CCA水解物脱脂后进行蛋白酶解,将大部分蛋白除去,然后通过阳离子交换柱收集GAG,使用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和CSABC酶将提取的GAG完全酶解为二糖,建立二糖的LC-MRM-MS/MS方法,将标准品和样品的二糖提取离子峰的峰面积积分,得到驴皮和CCA中的二糖组成及含量。我们对于驴皮制作为CCA的过程中GAG的作用有了基本的了解,发现硫酸皮肤素相对于硫酸乙酰肝素来说在CCA中含量多且稳定性强,推测其对于CCA的功效可能起到更重要的作用。3.人血浆中CCL5的富集及分析方法文献报道CCL5存在两个可能的O-糖基化位点及1-68,3-68,4-68三种不同的肽链长度,因此我们建立方法鉴定人血浆中天然CCL5的形式。血浆中CCL5的含量极低,因此首先使用自制CCL5的多抗琼脂糖凝胶亲和柱,富集人血浆中的CCL5,并进行质谱分析。最终我们鉴定到三种不同氨基酸长度的CCL5形式。而对于血浆中CCL5是否存在O糖基化,使用自制VVA凝集素亲和柱将样品中的O-GalNAc糖肽富集,并加入理论蛋白量的5%的内标同位素糖肽,最终通过质谱鉴定到加入的内标糖肽,验证了方法的可行性,但是没鉴定到糖基化CCL5的相关糖肽,说明人血浆中CCL5的糖基化形式低于5%。后续可以使用此方法分析CCL5含量较多的生物样品,从而对CCL5糖基化结构进行表征。4.建立CCL5异型体结构的定性定量方法由于人血浆中的CCL5的含量极低,因此根据CCL5的结构形式,设计并化学合成了 15种糖基化CCL5,包括不同氨基酸长度,不同糖基化和不同糖基化位点等差异。鉴定15种CCL5异型体的难点在于其中存在6组只有糖基化位点不同的同分异构体,由于这6组同分异构体的细小差异,色谱柱无法实现区分,而电子转移裂解(Electron Transfer Dissociation,ETD)碎裂可以保留糖链的完整性,在Ser4和Ser5之间产生特征的c/z碎片离子,从而鉴定位点差异的同分异构体。选择外标法作为定量方法,首先通过高能碰撞诱导(Higher Energy Collision Induced Dissociation,HCD)碎裂确定蛋白序列,根据m/z的不同将一级质谱信息分为9组,然后将其中质量相同的6组采用ETD碎裂方式通过特征碎片离子定量。因此我们结合质谱的HCD和ETD碎裂方式进行了全部CCL5异型体的鉴定和定量,从而建立了区分微小差异的同分异构糖蛋白的方法。将此方法首先用于CCL5-1和CCL5-7混合物过肝素柱后的洗脱液分析。CCL5-1是1-68序列长度且非糖基化的CCL5,CCL5-7是3-68序列长度且Ser4带GalNAc的,因此实验结果表明不同结构的CCL5与肝素的相互作用是有区别的,这为后续研究建立了基础。5.探究了 CCL5与肝素的相互作用及机理为了探究单类CCL5与肝素的相互作用,使用BLI,利用光的干涉原理,分析每种CCL5与肝素的相互作用,测定不同的KKD值。根据BLI的测定原理,KD值越小的相互作用越紧密,亲和力作用越大。将CCL5结构与KD值结合分析,结果表明,对于三个非糖基化异型体的形式,当两个氨基酸残基被截短时,结合亲和力略有降低,而如果再缺少一个氨基酸残基,则结合亲和力略有增加,说明截短与否对亲和力影响不大。Ser-5位置比Ser-4位置更为关键。在聚糖结构方面,与单糖残基相比,二糖残基通常对肝素结合具有更明显的影响。使用分子模型软件对CCL5-11、CCL5-14和CCL5-15与肝素八糖进行了分子对接模拟,发现Ser5和二糖糖基化通过影响CCL5与肝素的结合位点及结合碱性氨基酸的个数,从而影响了其相互作用的强度。为了探究混合情况下CCL5与肝素的相互作用,将不同CCL5混合过肝素亲和柱,收集出峰时的洗脱液,使用开发的分析方法进行定性定量,通过每个CCL5的洗脱量的不同,结合其结构分析,结果显示,不同的氨基酸序列改变,不同位置和种类的糖基化修饰,会对肝素亲和力产生各种不同的影响。同时,在不同组合中,各个异型体的相对亲和力保持一致。这表明某种修饰对CCL5异型体与肝素亲和力强度的排序是稳定的,不受不同的混合物组成的影响。但是由于其它异构体的影响,混合物中某类CCL5的亲和力与单类异构体的作用结果是不一样的。不管是单独结合还是混合结合,CCL5的Ser5糖基化位点带二糖的糖基化修饰对于CCL5与肝素相互作用的性质影响较大且稳定性较好,这些结果为我们提供了有关如何通过专门设计糖基化异型体来改变CCL5的生物活性的指导。综合本论文,我们首先建立质谱分析方法研究中药CCA的胶原蛋白和GAG,开发了 CCA来源鉴定的特征肽方法(已由山东省食品药品检验研究院申请中国药典的CCA补充检验方法),可以鉴定掺假0.5%的样品且区分驴、马和骡。然后,我们对CCA中的GAG糖单元进行了组成及含量分析。GAG和蛋白的相互作用与生物体内多种生理过程相关,我们选择肝素与CCL5的相互作用进行研究。首先使用CCA建立的质谱分析方法分析了人血浆中天然的CCL5。由于天然CCL5含量太低,为了分析复杂的糖蛋白混合物及研究GAG与CCL5的相互作用,我们合成了 15种存在序列长度、糖链和糖基化位点差异的CCL5异型体,并在CCA鉴定中积累的序列和糖单元分析方法基础上进一步开发了 CCL5异型体混合物的分析方法。通过BLI测定肝素与每种CCL5的亲和常数,采用开发的质谱分析方法对CCL5不同混合形式过肝素柱的洗脱液定性定量。综合BLI分析结果,我们发现Ser5带二糖这个结构对CCL5与肝素的相互作用影响较大。