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同源异型蛋白是一类含有同源异型结构域的转录因子,它们控制着许多细胞过程,包括细胞的增殖、分化、凋亡等,在胚胎发育中对组织和器官的形成具有重要的调控作用。在细胞核中,同源异型蛋白通过同源异型结构域组成的α螺旋-转角-α螺旋结构结合DNA,从而调控着下游基因的表达。 肌肉调节因子(MRFs)和肌细胞增强因子2(MEF2)是骨骼肌发生中的重要转录因子。此外同源异型蛋白对骨骼肌发生也起着重要的作用。Six1同源异型蛋白在早期肌源细胞决定、成肌细胞增殖、肌纤维形成和肌纤维类型决定中都起着重要的作用,它能够结合肌肉调节因子myogenin启动子上的MEF3位点,激活转录,引起成肌细胞的分化。胚胎期、婴儿期和成体分离出的成肌细胞中均能检测到同源异型蛋白Arx的表达,但是其在肌分化中的调控机制尚不清楚。 本研究应用成肌细胞C2C12体外分化模型,系统研究了同源异型蛋白Arx通过其核质分布的变化调控SIX1的表达进而调节C2C12细胞分化的分子机制。通过异核体细胞融合实验,我们首次发现并确定了Arx蛋白是一个核质穿梭蛋白。在缺失突变实验中,推断出Arx具有出核功能的酸性氨基酸结构域(a.a.200-250),应用蛋白质相互作用方法,初步确定了CAS是Arx的出核转运受体。同时我们观察到内源Arx在C21C2细胞的分化中有出核现象,即未分化细胞Arx主要分布在细胞核中,细胞分化时,Arx主要分布在细胞质中,而Arx在C2C12分化中的表达量并没有变化。通过对Arx可能作用的且与成肌细胞分化有关基因的启动子序列分析,我们推测SIX1基因可能是Arx结合的靶基因,应用荧光素酶活性检测实验,凝胶迁移实验和染色质免疫共沉淀实验,证明Arx可以直接与SIX1启动子结合,抑制Sixl的表达。另外我们还发现在C2C12细胞中,外源表达的Arx蛋白能够通过抑制Six1的表达阻止分化,并且Arx在缺失出核信号的情况下,抑制作用更加明显。相反,Arx同源异型结构域上382位点突变由于不能与SIX1基因结合而失去转录抑制功能,细胞分化正常进行。本研究首次提出了Arx通过核质分布的改变调控SIX1基因进而影响分化的理论。