高产5-ALA光合细菌的筛选和5-ALA合成酶基因的克隆研究

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5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是一种在大多数动植物体内都存在的五碳化合物,它是卟啉、血红素、叶绿素和维生素B12等四吡咯生物合成的中间代谢产物。5-ALA在农业和医药方面的应用效果越来越受到人们的关注。光合细菌(photosynthetic bacteria,PSB)是地球上最早出现的具有原始光合成体系的原核生物,广泛存在于自然界中,易培养、无毒害,在腐败有机物质浓度高的水域中更为常见。与其他生物相比,光合细菌(PSB)可以合成比其它生物浓度更高的5-ALA并分泌到细胞外,因此有着良好的研究价值。 5-ALA的生物合成有碳四和碳五两条途径,前者在非硫光合细菌中广泛存在。光合细菌合成ALA的C4途径的限制酶是ALA合成酶,在沼泽红假单胞菌属中该酶由hemA基因编码。 本论文从不同生态环境中分离培养出20株光合细菌,进行5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)的产量检测,对5-ALA产量最高的菌株R5的形态学、碳源利用情况等生理生化特性进行了研究;并以菌株R5基因组DNA为模板PCR扩增16S rDNA基因,对PCR产物进行了序列测定,并构建进化树进行系统发育分析。同时对5—ALA合成酶基因全序列进行PCR扩增,将PCR扩增产物克隆于pMD18-T Vector后测序鉴定。 结果筛选出一株分离自广州市云溪公园底泥的菌株R5,其5-ALA产量最高,达4.92 mg/L。参照《伯杰氏系统细菌学手册》,其形态特征和生理生化特征与红假单胞菌属相符合。菌株16S rRNA与Genebank中沼泽红假单胞菌KUGB306同源性达到99%,由此初步确定该菌株为沼泽红假单胞菌。同时成功克隆了5—ALA合成酶基因全序列,其测序结果推导氨基酸序列与Genebank中沼泽红假单胞菌KUGB306(Rhodopseudomonas palustrisKUGB306)比对,同源性为100%,故本研究克隆的基因为沼泽红假单胞菌的hemA基因,为后期获取高产5-ALA的基因工程菌打下基础。
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