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目的：研究抗病毒治疗过程中不同时期慢性乙型肝炎(chronichepatitisB，CHB)患者外周血浆细胞因子(IL-2、IL-6、IL-18、IP-10、IFN-γ、TNF-α)水平特征，并探讨其临床意义。通过对慢乙肝患者抗病毒治疗过程中不同时期外周血T细胞抗原受体beta链可变区((TCRβchainvariablegene，TCRBV)各基因家族克隆性扩增情况的比较，探讨抗病毒治疗过程中慢乙肝患者外周血T细胞群组成的变化，及外周血抗原特异性T细胞的变化情况。结合患者临床病程及本研究中的免疫应答物等参数，分析抗病毒治疗效果与机体免疫功能指标的关系，也为乙肝患者机体抗药性和长期药物治疗后耐药性的产生提供检测依据。
方法：
1．ELISA法检测血浆IL-2、IL-6、IL-18、IP-10、IFN-γ、TNF-α水平
选择慢乙肝患者33例，其中男20例，女13例，平均年龄32.56±8.61岁。按规范给予马来酸恩替卡韦抗病毒治疗，并分别于服用抗病毒药物前、治疗第12周、24周、48周分别采血，均空腹采血2管，每管5m1，1管分离血清用于肝功能及HBVDNA拷贝数检测，另一管抗凝后分离血浆和外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，采用双抗体夹心ELISA法检测细胞因子IL-2、IL-6、IL-18、IP-10、IFN-γ、TNF-α等水平，其中PBMC保存于-70℃备用。
2．基因熔解谱型图(genemeltingspectralpattem，GMSP)技术检测TCRBV基因CDR3谱型
根据文献设计、合成人T细胞TCRBV家族24个基因家族上游引物26条(BV5、BV13各有二个亚家族)和共同的T细胞抗原受体beta链恒定区基因(TCRβchainconstantgene，TCRBC)下游引物1条；TCRBC对照的TCRBCl引物1条、beta-actin上下游引物各1条。选择7例CHB患者(男5例，女2例，平均27.45±4.17岁)为研究对象，10例健康体检者(男5例，女5例，平均年龄28.73±4.87岁)为对照组，健康体检者留外周静脉血5ml。Ficoll试剂密度梯度离心法分离慢乙肝患者和健康献血者PBMC。提取总RNA，逆转录合成cDNA，以TCRBV基因24个家族特异性引物，实时荧光PCR结合DNA熔解曲线技术扩增24个TCRBV基因家族(包括完整的CDR3区)，建立TCRBV各基因家族的GMSP，根据TCRBV基因家族的GMSP特征，分析各家族的单/寡/多克隆性增生。
结果：
1．血清ALT、HBVDNA水平抗病毒治疗前及治疗后不同阶段有差别(F值分别为17.69，198.98，均P＜0.05)，其中ALT水平治疗后第12周、第24周、第48周与治疗前相比均有明显下降(均P＜0.05)；血清HBVDNA水平治疗后第12周、第24周、第48周与治疗前比较均有明显下降(均P＜0.05)，且治疗第24周与第12周之间、第48周与第24周之间、第48周与第12周之间比较均有明显下降(均P＞0.05)。血清ALT与HBVDNA水平间呈正相关，r为0.581、P值小于0.05。
2．血浆IL-18、IP-10水平抗病毒治疗前及治疗后不同阶段有差别(F值分别为7.59，14.14，均P＜0.05)，两者治疗后第12周、第24周、第48周与治疗前相比均有明显下降(均P＜0.05)；血浆IFN-r、TNF-a水平治疗前后均有差别(F值分别为3.845，20.156，均P＜0.05)，血浆IFN-r、TNF-a水平治疗后第24周与治疗前及治疗后第12周比较均有明显下降(均P＜0.05)，但血浆IFN-r水平治疗后第48周与治疗前、治疗后第12周、24周比较有明显上升(均P＜0.05)；血浆IL-2、IL-6水平治疗前后比较无显著性差异(F值分别为0.01，0.932，均P＞0.05)。
3．血浆IL-18、IP-10、IFN-r、TNF-a水平与血清ALT水平均呈正相关，r分别为0.323、0.663、0.396、0.316，P值分别小于0.05、小于0.01、小于0.05、小于0.05；血浆IL-2、IL-6水平与血清ALT水平之间无明显相关性。
4．血浆IL-18、IP-10、TNF-a水平与血清HBVDNA水平均呈正相关，r分别为0.382、0.559、0.286，P值分别小于0.05、小于0.01、小于0.05;血浆IL-2、IL-6、IFN-r水平与血清HBVDNA水平之间无明显相关性。
5．治疗前7例慢乙肝患者中有6例患者的TCRBV基因家族CDR3出现偏克隆(单或寡)扩增，出现异常扩增的家族总数共计34个；在健康献血者对照组，10例健康人中有3例出现偏克隆扩增，共计8个家族；慢乙肝患者TCRCDR3偏克隆扩增率高于健康对照组(单侧累积概率P≈0.036，0.01＜P＜0.05)。经抗病毒治疗后，随着HBVDNA水平下降(7例患者较治疗前均有明显下降，P＜0.05)，有2例慢乙肝患者TCRBV由偏克隆扩增向多克隆转变，但治疗后偏克隆扩增率与治疗前比较无差别(双侧累积概率P≈0.559，P＞0.05)。
6．对在基因熔解谱型图(genemeltingspectralpattern，GMSP)上表现为单峰的TCRBV基因家族进行测序，发现慢乙肝患者TCRBV某些TCRBV基因家族出现单克隆扩增，我们研究的7例样本中，没有发现相同TCRBV基因序列，但单一患者在治疗过程中单克隆扩增的某-TCRBV基因家族的CDR3序列是不变的。
结论：
1．抗病毒(马来酸恩替卡韦)治疗后CHB患者外周血浆细胞因子IL-18、IP-10、IFN-r、TNF-a水平随着HBVDNA水平的下降，而有不同程度的下降，并且与血清ALT水平或HBVDNA水平有一定的相关性，表明细胞因子参与了慢乙肝的发病过程，其血浆水平不但可以反映抗病毒治疗过程中患者机体的免疫功能状态的动态变化，而且可以作为抗病毒药物疗效评价的参考指标；HBVDNA水平下降也表明抗病毒治疗可使细胞免疫功能有所恢复，从而强化机体清除HBV的能力。
2．与健康献血者比较，CHB患者TCRBVCDR3基因家族的偏移率(skewedfrequency)较高，但在接受马来酸恩替卡韦抗病毒治疗后，随着HBVDNA表达量的下降，TCRBV基因家族的偏移情况(单/寡克隆性扩增)有好转，TCRBV基因有向多克隆扩增转变的趋势，提示抗病毒治疗有利于CHB患者细胞免疫功能恢复。另外慢乙肝患者出现的单克隆扩增TCRBV基因家族，可能慢乙肝的发病有关。单一患者在抗病毒治疗中的始终出现单克隆TCRBV基因家族，可能与CHB的病程进展和抗病毒治疗预后有关，但是否预示病情好转或恶化，还需结合扩大样本量作进一步研究。