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根据最新的世卫组织WHO统计报导,在全球范围内,2008年新增加约482,300例食管癌病例,死于食管癌的患者406,800例,不同的国家之间发病率差异较大者约16倍,其中发病最多见的是南非,东非与东亚,包括埃塞俄比亚,中国与蒙古。食管癌在世界范围最常见肿瘤类型的第6位。疾病特征包括进展迅速,大多数病患预后极差。5年总体生存率大约15%。叶酸受体在多种人类肿瘤细胞表面过表达,可通过叶酸-叶酸受体特异结合介导的胞吞作用来传递叶酸-药物共轭聚合物。基于配体受体的特异结合,通过共聚制备键合叶酸与键合紫杉醇的聚合物胶束依据合理的配比组成混合胶束微粒,组装后的叶酸键合胶束的叶酸含量为质量比1.4%,紫杉醇键合胶束中紫杉醇含是为质量比25%,这两种胶束以1：9的比例制备成混合胶束。混合胶束溶于水,形成壳-核形微粒,将活性药物紫杉醇包裹而保护在壳内,避免或减少活性药物在血液循环过程中的非特异释放或非目的性释放,减少毒副作用,同时达到靶区组织的治疗作用。理论上认为具备聚合物纳米微粒基于EPR效应的被动靶向效应,与叶酸介导的基于配体受体结合的主动靶向效应。本实验以人源性食管癌细胞等的体外细胞实验与小鼠体内荷瘤实验来验证混合纳料胶束的抗肿瘤作用。主体实验部分是免疫力缺陷的裸鼠构建的皮下荷瘤模型,分组应用药物后记录瘤径变化,选择时间点取出肿瘤组织,测其重量与体积差异；生存时间分析；流式细胞仪、原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测不同剂型的紫杉醇药物对食管癌细胞的促凋亡作用；同时进行免疫组化检测与病理生物学检测食管癌细胞凋亡相关蛋白的表达差异以及形态学的比较。本次实验的结果显示,在紫杉醇药物当量为20mg／Kg时,叶酸-紫杉醇键合混合胶束的抑瘤活性优于紫杉醇纯药与键合紫杉醇胶束,认为增强的抑瘤效应归因于混合胶束共聚后外壳表面携带的质量比为1.4%的叶酸介导了对肿瘤组织的主动靶向与胞吞作用。因此,同时键合叶酸与紫杉醇于嵌段共聚物的疏水基团,共聚化形成的紫杉醇聚合物与叶酸聚合物胶束是一项装载与制备靶向治疗药物的有效途径。抗肿瘤活性药物紫杉醇稳定细胞内微管,抑制微管活动,促使有丝分裂中断并诱导细胞凋亡,已广泛应用于临床化疗。但是由于紫杉醇活性药物本身水溶性低,对机体存在非特异的全身性毒副作用,因而限制了其应用。为此,开发紫杉醇载体是有效解决这些缺点的策略之一。而靶向传递紫杉醇到肿瘤组织或细胞的载体需要具备以下特征：(1)全身毒副作用减少；(2)增强紫杉醇在肿瘤组织的蓄积,并延长滞留时间；(3)局部达到有效剂量仅需要较少的紫杉醇纯药用量；(4)增强紫杉醇溶解性。此外,设置了键合紫杉醇胶束与紫杉醇纯药分组的比较,检测基于EPR效应的紫杉醇键合胶束对肿瘤组织的被动靶向效应。双亲性嵌段共聚物构建的纳米胶束因其优异的理化特性与机械强度,对活性药物的保护作用,低毒性,良好的生物相容性与可降解等特点,长春应化所实验室自主合成了多种聚合物胶束载体。为解决药物突释作用,载药聚合物在侧链键合活性药物分子后,通过自组装作用,将活性药物分子包裹而保护在壳-核结构的内部,从而减少了药物因为弥散作用而丢失。载药聚合物胶束有良好的水溶性,因而可以血管注射用药,增加了生物利用度。在肿瘤组织,载药聚合物通过配体-受体用介导的胞吞作用进入细胞内,继而在胞内的酸性环境下,触发释放活性药物分子而达到抑瘤作用。叶酸作为主动靶向基元,具有其他配体更大的优势作用：包括(1)与一般蛋白类配体不同,叶酸无免疫原性；不引起过敏反应；(2)叶酸受体在大约90%非粘膜源卵巢癌细胞表面表达。在上皮组织来源的肿瘤细胞表面过表达,包括肾脏,脑,肺,乳腺等。叶酸受体的表达与肿瘤分型相关。基于叶酸-叶酸受体的特异结合,载叶酸的药物在叶酸受体过表达的肿瘤组织细胞呈靶向蓄积效应；(3)因为叶酸分子小,结构简单,对药物动力学影响极小；(4)以叶酸为靶向基元合成药物的成本较低,合成与纯化较简单；(5)叶酸的羧基易与羟基和氨基反应,其反应产物保持内在活性。基于这些优势,叶酸已应用于多种药物修饰,包括脂质体,聚合物,等。近来,叶酸通过羧基与氨基的反应与三嵌段共聚物键合,理论上可以增强细胞对药物的摄取而在体内叶酸键合胶束在荷瘤部位靶向浓积。在本研究中,叶酸被选择为靶向基元,通过酯键结合在侧链上,构建功能性聚合物胶束。紫杉醇键合在另一聚合物载体上。两种聚合物制备为混合胶束,自组装形成载药的壳-核结构复合纳米微粒。组装的胶束存在良好的理化特性,包括水溶性,血液中循环时间延长,生物可降解性,叶酸受体靶向效应与增强的细胞摄取作用。为检测混合胶束的抗肿瘤效应是否优于单一载药纳米微粒,而选用人源性食管癌细胞EC9706进行体外细胞实验与动物体内实验。本实验结果与结论如下：1.体外实验1.1MTT法检测细胞毒效应：将对数生长期的EC9706细胞计数后,重接种于96孔板内,分为空白对照组,紫杉醇纯药组,键合紫杉醇胶束组,叶酸-紫杉醇混合胶束组。每组取一组呈梯度增加的浓度,纯药紫杉醇当量为0.001g／ml-100g／ml。再设置不同的时间点,包括24h,48h,72h。分别进行检测。三组药物均表现抑瘤作用,随药物浓度增加而抑瘤率增加,随作用时间的增加而抑瘤率增加,呈典型的浓度依赖与时间依赖效应。计算其半数最大抑制浓度(IC50)分别为：24h检测点,纯药紫杉醇的IC50为(13.96±0.73)g／ml,而24h时间点,两组键合胶束的浓度在0.001g／ml-100g/ml时,抑瘤率均在50%以下：48h检测点,纯药紫杉醇,键合紫杉醇胶束与叶酸-紫杉醇混合胶束的IC50为别为(0.11±0.03),(22.75±0.84),and(21.07±0.38)g／ml;而在72h检测点,三组药物的IC50分别为(0.04±0.01),(7.75±0.12),and(2.13±0.07)g／ml。提示在体外细胞毒实验中,相同浓度下,或者相同的作用时间下,紫杉醇纯药的抑瘤率最大,体外抑瘤效应呈以下趋势：M(PTX) FA-M(PTX)<PTX。1.2Annexin V/PI双染检测细胞凋亡率：结果提示,在不同的时间点,24h,48h,72h,三组药物的早期凋亡率均较空白组增加,并呈现出一定的时间依赖效应,作用时间延长,细胞总凋亡率增加,在24h时间点,三种药物作用组之间无统计学差异, M(PTX) FA-M(PTX) PTX;而在48h与72h时间点,三种药物的诱导凋亡率呈以下趋势：PTX<M(PTX) FA-M(PTX)。2.体内实验2.1抑瘤实验：57只裸鼠构建EC9706皮下荷瘤模型成功,用于检测抑瘤效应。分为空白组与三种药物组,紫杉醇当量为20mg／kg体重。治疗后第12天,小心取出每只裸鼠皮下荷瘤,依据肿瘤体积大小与肿瘤净重计算,其增殖抑制率存在以下趋势:FA-M(PTX)> M(PTX)> PTX>对照组。其中叶酸-紫杉醇复合胶束组抑瘤率与纯药组或紫杉醇胶束组存在统计学差异(P<0.05)。而紫杉醇组、紫杉醇键合胶束组之间无统计学差异。2.2流式细胞仪检测荷瘤组织的细胞凋亡率：叶酸-紫杉醇复合胶束组抑瘤率与纯药组或紫杉醇胶束组存在统计学差异,三种药物组比较,总凋亡率存在以下趋势：对照组<PTX M(PTX)<FA-M(PTX),而紫杉醇组、紫杉醇键合胶束组总凋亡率比较,P=0.122。2.3TUNEL法检测细胞凋亡率与凋亡形态学改变,以灰度值计算总凋亡率。与对照组比较,各药物组呈现显著的促凋亡效应。药物组间进行比较,混合胶束组促凋亡率与纯紫杉醇组、键合紫杉醇组比较,存在统计学差异,P<0.01；而紫杉醇纯药组与键合紫杉醇胶束无统计学差异。2.4免疫组化检测凋亡相关蛋白的表达,与TUNEL相同,应用ImagePlus软件分析染色切片的灰度值,反映肿瘤组织Bax, Bcl-2, Caspase-3与survivin的表达量。在Bax与Caspase-3,灰度值趋势为：对照组> PTX M(PTX)> FA-M(PTX);而在survivin与Bcl-2,灰度值趋势：对照组<PTX M(PTX)<FA-M(PTX),复合胶束组与其他组比较,存在显著差异。这一结论与抑瘤率检测结果和总凋亡率检测结果一致。2.5HE染色病理组织学检测,证实为人源性食管癌细胞EC9706荷瘤组织,其中可以观察到凋亡形态学改变。2.6生存分析：101只裸鼠随机分为4组,给药之前,各组荷瘤体积无统计学差异,组间可比性良好。在相同的生存条件下,记录每只裸鼠的生存时间,每隔1天记录裸鼠荷瘤体积。以SPSS统计学软件生成Kaplan-Meier生存分析曲线,记录肿瘤体积随时间的变化,分析各组药物的疗效。实验各组中位生存时间与平均生存时间进行Log-rank检验。结果显示,与空白组、紫杉醇组、单一键合紫杉醇胶束组比较,复合胶束显著延长荷瘤裸鼠的生存时间,抑制荷瘤组织生长；三组药物之间比较,生存时间PTX<M(PTX)<FA-M(PTX)。证实叶酸紫杉醇复合胶束的体内抑瘤作用的优势,有进一步研究的价值。