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虫媒病毒是指一些通过吸血节肢动物叮咬敏感脊椎动物而引起的自然疫源性疾病及人兽共患病的一群病毒,大部分为黄病毒科黄病毒属病毒、披膜病毒科甲病毒属病毒和布尼亚病毒科病毒,对人类危害极大。近些年来,我国先后发现多种布尼亚病毒科虫媒病毒,包括发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV),塔希纳病毒(Tahyna virus,TAHV),巴泰病毒(Batai virus,BATV);除此之外,还有黄病毒属朝阳病毒(Chaoyang Virus,CV);甲病毒属盖塔病毒(Getah virus,GETV),证明国内不存在虫媒病毒很可能通过各种途径进入我国。就TAHV的流行趋势而言,该病毒属于布尼亚病毒属加利福尼亚血清组,于1958年在前斯洛伐克的伊蚊中分离出,随后在欧洲广泛流行,继而在苏联发现。1985年在我国新疆对成年人进行血清学调查时,曾检出过TAHV的抗体,至2006年在新疆喀什地区分离到该病毒。加之我国现已存在布尼亚病毒属病毒,具备其流行的生态学条件;因此,不能排除我国存在其它加利福尼亚血清组病毒的可能。加利福尼亚血清组病毒主要成员有加利福尼亚脑炎病毒(California encephalitis virus),瓜鲁病毒(guaroa virus),Inkoo virus,詹姆斯敦峡谷病毒(Jamestown Canyon virus),拉克罗斯病毒(La Crosse virus,LACV),雪靴野兔病毒(Snowshoe hare virus,SSHV)以及TAHV等。LACV自1964年从死于脑炎的少儿患者脑组织分离出以来,在美国被认为儿童病毒性脑炎的最常见病原之一。SSHV在自然界有很高的隐性感染率,在我国的多项调查中,均显示部分地区血清中存在SSHV抗体。对于虫媒病毒的监测,一方面是对我国还未发现的虫媒病毒加强监测,防止其传入我国;特别是我国血清学调查显示呈抗体阳性,却并未分离到的虫媒病毒,更应作为监测的重中之重。否则一旦有新的虫媒病毒性疾病发现或流行,将无法判断是本土疾病还是从国外传入的传染病。另一方面则是对我国已存在的重大虫媒病毒进行监测,防止其再次流行,对公共财产造成不可挽回的损失。世界卫生组织称,全球蔓延最快的虫媒传播疾病是黄病毒属登革病毒引起的登革热,威胁着100多个国家和地区25亿人口。因此,口岸及边境地区应做好出入境人员的传染病监测工作,加强我国各口岸检验检疫机构与越南、老挝等国外卫生检疫机构的信息交流和合作,及时发现当地人口重大虫媒病毒携带情况。第一部分拉克罗斯病毒和雪靴野兔病毒荧光rt-pcr方法的建立和初步应用目的:本研究拟开展尚未传入我国的重要虫媒病毒,特别是入境医学媒介携带虫媒病毒的快速检测技术研究,分别建立lacv和sshv荧光rt-pcr检测方法,并初步应用于国境口岸虫媒病毒监测。方法:从genbank中检索lacv、sshv全基因序列,通过mega4软件进行序列对比,blast进行保守序列分析,选取s基因片段为模板。利用beacondesigner7.0软件设计其特异引物和taqman探针。进行荧光rt-pcr检测并优化反应条件和引物浓度,退火温度设定为45℃、50℃、55℃和60℃;探针终浓度设定为100nm、200nm、400nm;上下游引物终浓度分别为200nm、400nm、800nm,通过扩增曲线与ct值分析确定最佳引物和探针浓度并验证该方法的敏感性和特异性。将建立的新方法进行初步应用,对2014年6、7两月,位于云南中老磨憨口岸捕获的蚊虫进行检测,调查其携带lacv、sshv情况。结果:1.建立了lacv荧光rt-pcr检测方法,其最佳退火温度为55℃,引物终浓度为200nmol/l、探针终浓度为200nmol/l。该方法敏感度达1.41×103copies/μl;与甲病毒属、黄病毒属、布尼亚病毒属和东南亚十二节段rna病毒属病毒均无交叉反应。2.建立了sshv荧光rt-pcr检测方法,其最佳退火温度为55℃,引物终浓度为200nmol/l、探针终浓度为200nmol/l。该方法敏感度达5.6×102 copies/μL;与甲病毒属、黄病毒属、布尼亚病毒属和东南亚十二节段RNA病毒属病毒均无交叉反应。3.利用新建立的LACV和SSHV荧光RT-PCR方法检测338批蚊虫样本的RNA,并未发现阳性结果。结论:建立的LACV和SSHV荧光RT-PCR方法灵敏度高、特异性好,适合于国境口岸的快速检测。第二部分中老边境重要虫媒传染病血清流行病学调查目的:选取边境地区出入境健康人群血清,筛查DENV和CHIKV感染及流行情况,对疾病的预防和监控提供数据支持。方法:采用ELISA方法检测云南磨憨口岸地区健康出入境人群血清中CHIKV和DENV两种病毒的IgG抗体,采用Excel和SPSS17.0软件统计分析,针对采样构成比、检出阳性率以及职业、年龄和性别三种属性进行χ2检验,比较其组间阳性率是否有差异。结果:血清学调查共检测182份血清样本,CHIKV和DENV IgG抗体共检出42份阳性。CHIKV的阳性感染有39份(21.42%),DENV有3份阳性(1.65%),总阳性率为24.08%。两种病毒在性别和年龄上的阳性率并无显著差异。在职业分类中,经商者DENV抗体阳性较其他职业具有显著差异。结论:血清学调查显示磨憨地区CHIKV的抗体阳性率较高,达到21.42%,DENV抗体为阳性的经商者较其他职业(服务员、学生、后勤人员、船员)具有显著差异。