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肢体动脉硬化性闭塞症 (ASO) 是因动脉粥样硬化 (AS) 导致肢体缺血甚至坏疽的严重疾病, 属于周围血管疾病中难治性疾病. 经皮腔内血管成形术 (PTA) 是治疗ASO的有效疗法之一. 然而, 在PTA后六个月内约有30~50%的病人发生再狭窄( RS)极大地影响了该疗法的效果, 成为阻碍PTA推广运用的障碍. 因此 ,防治PTA后RS是提高PTA远期疗效的关键,也是国内外血管病研究者极为关注的课题之一. 通脉宁胶囊是陈淑长教授临床用于治疗ASO 及防治PTA 后RS 的有效方剂 ,具有益气活血, 通脉止痛的功效. 前期临床及动物实验显示其具有抗PTA后RS的作用 .研究表明RS的形成是一个十分复杂的病理过程, 涉及到多个环节和众多因素, 其中血管平滑肌细胞( VSMC)增殖是其主要关键病理环节之一 .本研究以VSMC为靶细胞 ,应用血清药理学研究的方法, 观察通脉宁全方及益气拆方, 活血拆方对血管紧张素II(AngII), 溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 诱导VSMC 增殖及相关因素的影响 ,以阐明通脉宁防治PTA 后RS 的细胞分子机制. 应用通脉宁全方及拆方提取液 ,分别连续灌胃日本大耳白兔3 d后取血, 制备相应的药物血清. 采用组织贴块法分离培养乳兔主动脉 VSMC. 经免疫组织化学染色鉴定,α-actin呈阳性. 随机将生长良好的第4~5代VSMC细胞分别以AngII, LPC为诱导因素分为空白组,AngII 组, LPC 组, 通脉宁全方组, 益气拆方组 ,活血拆方组进行以下实验研究. 1. 运用 MTT 比色法整体观察对 VSMC 增殖活性的影响; 2. 通过免疫组织化学染色法 (DAB 显色), 观察细胞胞浆α-肌动蛋白表达变化规律; 3 应用流式细胞仪定量检测细胞周期的改变; 4. 通过生物化学方法测定细胞培养上清液中总SOD 活力及MDA 含量的变化; 5. 采用硝酸还原酶法, 观察对细胞培养上清液NO 含量以及NOS 酶活力的调节; 6. 采用 Fluo-3 染色荧光探针标记检测细胞内钙离子荧光强度的变化; 7. 通过免疫组织化学染色法 (DAB 显色), 检测细胞胞浆PDGF-BB蛋白表达变化; 8. 采用 RT-PCR 法半定量检测 VSMC 的调控基因c-fos 和 c-myc 表达的改变规律. 实验结果显示, AngII, LPC 通过增加体外培养VSMC 增殖活性( OD 值 ),降低α- actin表达, 提升细胞S期, G2/M期百分比 ,降低G0/G1期百分比, 改变细胞培养上清液中NO, MDA含量, 减弱NOS ,SOD 活力, 升高细胞内Ca2+浓度, 增加胞浆PDGF-BB 表达 ,上调VSMC 的调控基因c-fos和c-myc表达 ,发挥促进VSMC增殖的作用. 通脉宁通过降低OD值 ,增加α-actin表达 ,减少细胞S期, G2/M期百分比, 增加G0/G1期百分比, 增强NOS, SOD活力及NO含量,减少MDA 生成 ,降低细胞内Ca2+浓度 ,减弱PDGF-BB 表达, 下调c-fos 和c-myc 表达, 发挥拮抗 AngII, LPC 诱导作用 ,抑制 VSMC 增殖的综合效应( P<0.01),虽然益气拆方及活血拆方组也可在一些环节显现抑制VSMC的作用, 但经过综合分析比较, 其作用不及通脉宁全方. 研究结果表明 ,通脉宁通过对细胞信息传递中的最终靶分子c-fos, c-myc等核内基因表达的影响 ,调控细胞表型转化, 阻断作为第二信使的 NO ,Ca2+, 自由基等的细胞信号转导途径 ,干预RS形成过程中发挥重要介导作用的PDGF-BB表达等环节的协同作用, 达到抑制<WP=6>VSMC 增殖, 迁移 ,防止 PTA 后 RS 形成的目的 .因此 ,通过本实验研究 ,说明了通脉宁中医辨证组方的合理性, 严谨性, 从另一方面也阐明了通脉宁防治PTA后RS的生物学基础, 为中医药防治PTA后RS新体系的建立提供了科学依据及理论基础