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去氢甲睾酮(DMT)是一种人工合成的外源蛋白同化激素,能显著促进动物肌肉生长,但其在人体内积累会给人体健康造成影响。
目前DMT残留检测主要采用仪器分析的方法,但由于实际样品中残留物浓度低、组分复杂等因素,在进行仪器分析时常需要对样品进行净化处理。与其他样品前处理技术相比,免疫亲合色谱(IAC)有着特异性强、操作简便、重复性好等优点,因而被广泛应用于食品中兽药、农药残留检测。本研究通过将DMT抗体与琼脂糖或壳聚糖载体偶联制备得到了三种DMT免疫亲和柱,并对其性能及样品净化处理中可能的应用前景进行了评价。主要结果如下:
1.免疫得到的DMT抗血清用Hitrap Protein A-Sepharose4B亲和层析柱进行纯化,得到的DMT多克隆抗体与CNBr-Sepharose4B凝胶进行偶联,制各得到DMT多抗免疫亲和柱。柱子性能的评价方法采用间接竞争ELISA(icELISA)法和HPLC法。抗体与凝胶偶联的最佳时间为2.5 h,抗体最佳初始浓度为0.5 mg／mL；该免疫亲和柱的柱容量约为170 ngDMT／0.1 g干胶；最适洗脱条件为5 mL80％的甲醇.水溶液,柱子平均回收率为97.87％,柱子之间的变异系数为6.67％；柱子重复使用3次,回收率仍不低于90％,且和丙酸睾酮(TP)、群勃龙(TB)没有交叉反应,特异性良好；在实际样品的检测中,空白猪肉和饲料样品中都分别加标1.2 ng／g、4.8 ng／g,回收率为74.87％～107.15％,CV小于9.78％；
2.杂交瘤细胞注入BALB／c小鼠腹腔,制备出腹水型单抗,用正辛酸.饱和硫酸铵法纯化得到DMT单克隆抗体,将其与CNBr-Sepharose4B偶联得到免疫亲和柱。抗体与凝胶偶联的最佳时间3.0 h,抗体最佳初始浓度为0.15 mg／mL；该免疫亲和柱的柱容量约为2400 ng DMT／0.1 g干胶；最适洗脱条件为5 mL70％的甲醇.水溶液,柱子平均回收率为88.55％,柱子之间的变异系数为8.45％；该亲和柱能重复使用3次,且特异性良好；在实际样品的检测中,空白猪肉和饲料样品中都分别加标1.2 ng／g、4.8 ng／g,回收率为71.11％～100.75％,CV小于8.83％；
3.采用反相悬浮交联法制备了交联壳聚糖,将DMT单克隆抗体与之偶联制备成免疫亲和吸附剂,填充入柱即得到免疫亲和柱。用红外光谱对各阶段的反应物进行结构表征,证明壳聚糖己交联且抗体己成功偶联。抗体与交联壳聚糖最佳的偶联条件为pH8.0、时间8 h、温度40℃、戊二醛终浓度0.6％；该亲和柱最适洗脱条件为3 mL90％的甲醇-水溶液,柱容量约为1800 ng DMT／0.1 g交联壳聚糖,柱子平均回收率为92.25％,柱子之间的变异系数为7.95％；重复使用次数为2次；该柱有非特异性吸附,与丙酸睾酮(TP)、群勃龙(TB)的交叉反应率分别为24.90％和28.04％,还需对其结构和交联过程进行修饰和完善；在实际样品的检测中,空白猪肉和饲料样品中都分别加标1.2 ng／g、4.8 ng／g,回收率为54.49％～90.04％,CV小于13.23％。