硼酸亲和色谱填料的合成及其在糖蛋白分离的应用

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糖化蛋白是一种经过糖基化修饰的蛋白,具有特殊的结构和功能,作为生物体内重要成分,在细胞粘附、免疫响应、病毒入侵和信号传递中起着重要作用,同时由于其特殊性质,糖化蛋白的价值越来越得到人们的认可:包括在食品工业的辅助营养成分、新型特种药物和生化试剂的应用。然而高丰度非糖蛋白质的大量存在会对体系中含有少量糖蛋白质产生夹带、包覆以至掩盖的作用,而传统的糖蛋白在分离、纯化及检测方面效率较低,存在明显不足,因而亟待开发一种新型色谱填料,发展一种新型、高效的分离方法。本研究主要内容包括:  ⑴利用油水乳化法,制备具有壳-核结构的琼脂糖/玻璃珠复合材料,并偶联氨基苯硼酸,得到一种新型的亲和填料。对影响制备过程的琼脂糖/玻璃珠质量比、乳化剂的含量、环氧基团活化密度进行了优化。结果表明,其对辣辣根过氧化物酶(糖蛋白)的饱和吸附量为85 mg/g,远大于牛血清蛋白(非糖蛋白)6 mg/g的吸附量,并在2 mL/min流速下实现了对人血红细胞中糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白的分离,在亲和色谱方面具有较大的应用前景。  ⑵以2-甲基-2-丙烯酸-2,3-二羟基丙酯为单体,聚乙二醇二甲基丙烯酸酯,聚二季戊四醇六丙烯酸酯为复合交联剂,分别考查了搅拌转速、聚合时间、致孔剂比例对合成的亲水型聚甲基丙烯酸甲酯影响。并通过活化,固定氨基苯硼酸,对其进行高压装柱,实现了对糖化血红蛋白分离,通过对分离产物采取聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进一步验证。  ⑶选用4-乙烯基苯硼酸(VPBA)为亲和单体,乙二醇/二甘醇为致孔剂,在常规液相色谱柱内,通过乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)交联作用原位聚合,制备了一种硼酸整体柱。其对辣根过氧化物酶(糖蛋白)的动态吸附量为2.338 mg/g,大于牛血清蛋白(非糖蛋白)0.025 mg/g。在高效液相色谱分离中,该柱可快速分离含顺式羟基的化合物,进一步应用于对人全血样品的糖化血红蛋白分离,表现了优良的分离性能,且准确度与酶法测试结果相近,重复性相对标准偏差RSD=2.6%。
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