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鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是一种由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease,IBDV)引起的鸡的急性、高度接触性传染病,病毒感染会引起鸡的免疫抑制,给养禽业带来巨大危害。VP4、VP5蛋白是法氏囊病毒基因组编码的两种重要非结构蛋白,在病毒的感染中有重要的作用。1.鸡传染性法氏囊病毒的VP4、VP5蛋白对病毒感染引起的免疫抑制作用研究为探讨IBDVVP4、VP5蛋白在病毒感染引起的免疫抑制中的作用,本研究将构建了 VP4、VP5蛋白的真核表达质粒并转染DF-1细胞,并用Poly IC刺激或IBDV CV03病毒株感染转染后的细胞,Western-blot方法检测细胞中模式识别受体及下游转录因子的表达;荧光定量PCR检测细胞因子及抗病毒基因的表达。结果显示,VP4蛋白能够促进TLR3mRNA的转录与蛋白的表达,尤其是在Poly IC刺激或IBDV CV03病毒感染后刺激作用更显著;而VP5蛋白对TLR3 mRNA与蛋白的表达表现出显著抑制作用;IBDVCV03毒株感染能够刺激TLR3 mRNA的大量表达,但其蛋白表达水平却很低。VP4、VP5蛋白在IBDV CV03毒株感染时都显著抑制MDA5蛋白的表达。进一步检查下游的转录因子发现,VP4、VP5蛋白均能促进IRF3蛋白的表达,但在CV03毒株感染后均表现出抑制作用;VP5还能显著抑制IRF7蛋白的表达;VP5蛋白能够抑制I型IFN mRNA的转录,对白细胞介素IL-1β、IL-6 mRNA的转录表达都有一定的抑制作用。另外,CV03毒株的感染整体上显著抑制了抗病毒蛋白Mx基因的表达。结果表明,IBDV可通过VP5蛋白抑制模式识别受体TLR3 mRNA的转录及蛋白的表达,阻止信号向下游传递,也可通过抑制MDA5蛋白的表达来实现;对模式识别受体下游转录因子的检测结果说明,IBDV对机体的免疫抑制作用可通过抑制IRF3蛋白的表达来实现的,而对IRF3蛋白表达的抑制作用主要由IBDV的VP4和VP5蛋白共同执行;另外IBDV也通过VP5抑制IRF7 mRNA的转录及其蛋白表达来达到免疫抑制作用。IBDV与DF-1细胞互作过程中的免疫抑制作用主要通过VP5蛋白来实现,VP4起辅助作用。2.VP4、VP5蛋白在鸡传染性法氏囊病毒感染过程中对非干扰素通路的影响为探讨VP4、VP5蛋白在鸡传染性法氏囊病毒感染过程中对宿主非干扰素通路的影响,本研究将所构建的VP4、VP5蛋白的真核表达质粒转染Ⅰ型干扰素表达缺陷型细胞Vero细胞,并用IBDV CV03病毒株感染转染后的细胞,Western-blot方法检测细胞中模式识别受体及其下游转录因子的表达;荧光定量PCR检测细胞因子及抗病毒基因的表达。结果显示,VP4蛋白在IBDV CV03病毒感染后在一定程度上能够提高TLR3、RIG-I的蛋白含量但差异不显著;VP5对TLR3、RIG-I等介导的天然免疫通路有一定的抑制作用;过表达的VP5在IBDVCV03病毒感染后显著抑制了 IRF3的表达及其磷酸化水平,也显著抑制了 IRF7和NF-κB的表达,并在抑制NF-κB后抑制了 TNF-α,而过表达VP4无此作用。结果说明,VP5蛋白对相关信号通路(宿主的非Ⅰ型干扰素产生途径)有一定的抑制作用,这种抑制作用和核转录因子及TNF-α的抑制密切相关。另一方面,VP4和VP5蛋白在Vero细胞中的过表达对IBDV的感染和复制的影响目前还不清楚,有待我们进一步的研究探讨。3.VP4、VP5蛋白对病毒感染引起的细胞损伤的影响为探讨VP4、VP5对IBD病毒感染引起的细胞损伤的影响,本研究通过流式细胞检测技术,观察VP4、VP5蛋白表达后(或有Poly IC刺激或有IBDV CV03毒株感染)DF-1细胞内活性氧的水平,并用试剂盒检测DF-1细胞内SOD和NAG酶的活性以及细胞内LD的含量。结果显示,VP4、VP5蛋白均能刺激DF-1细胞活性氧的产生,同时SOD活性显著增加,LD含量增加;当有Poly IC刺激或IBDV CV03毒株感染时,活性氧的产生有所下降,而SOD活性依旧呈增加状态,但增加量有所下降,LD含量增加;VP4和VP5蛋白对NAG活性均未表现出明显影响。结果表明,IBDV感染中的细胞损伤很可能是宿主的免疫系统识别病原后作出的过激反应。IBDV感染后细胞内活性氧水平降低及SOD作为体内的抗氧化系统,活力减弱,可能是细胞损伤有所减少,表明IBDV感染可能会抑制细胞损伤或死亡,这可能有利于病毒在细胞内的复制。