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甲型流感病毒可引起年度季节性流感和反复的流感大流行,严重危害人民健康。近年来甲型H1N1流感的流行和人感染H5N1禽流感病毒病例不断增加,进一步提示加强甲型流感病毒的研究和防控的重要性。血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是甲型流感病毒编码的表面糖蛋白。根据HA和NA的抗原性,甲型流感病毒可分为16个HA亚型(H1～H16)和9个NA亚型(N1-N9)。HA和NA的重组和重配产生新的病毒是造成流感大流行的重要原因。理论上16个HA和9个NA亚型可自由组合形成144种亚型流感病毒,多数亚型流感病毒已在自然界被发现,但引发大流行的流感病毒的亚型种类仍无法预测。因此,加强亚型特异性快速诊断、加强监测能力以及时发现流行的流感亚型的变化是应对流感大流行重要基础。为此,本研究构建了涵盖各亚型流感假病毒系统,为流感病毒中和抗体的快速检测鉴定以及深入研究HA和NA的功能提供材料和手段；另一方面,通过建立基于表位的甲型流感病毒亚型特异性检测技术为发展新型的流感病毒亚型检测、监测技术提供基础和依据。一、甲型流感病毒各亚型假病毒系统的构建构建了16个HA亚型(H1～H16)的真核表达质粒,用相应的亚型特异性抗体对HA的表达进行了免疫印迹验证,结果表明所有16个亚型HA均获得表达。对除H5和H7外的14个亚型HA的切割位点进行了改造,将切割位点由单碱性氨基酸突变为多碱性氨基酸,免疫印迹结果表明切割位点改造不影响HA的表达,其中H1、H6、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16HA经改造后发生切割,H2、H3、H4和H8HA改造后仍未切割。同时,构建了9个亚型NA (N1～N9)的真核表达质粒,用亚型特异性抗体(N3～N9)进行免疫印迹检测验证了相应NA的表达,并用商品化的神经氨酸酶检测试剂盒对细胞裂解液的酶活性进行了检测,结果表明9个NA的裂解液中具有很强的神经氨酸酶活性,间接证明了9个NA亚型的正确表达。将16个HA亚型和9个NA亚型组合包装假病毒,144种假病毒感染293T细胞的结果根据HA的切割情况及与不同NA组合的感染能力可分为四组。H5、H6、H7和H94个HA亚型均切割表达且与9个NA形成的假病毒均能感染细胞；H1、H10～H168个HA亚型能切割表达但只有与部分NA形成的假病毒具有感染性；H2和H8两个HA亚型不切割但与部分NA形成的假病毒具有感染性；H3和H4两个HA亚型不切割且与所有NA形成的假病毒都不能感染细胞。这些结果提示不同亚型HA在切割性和假病毒感染性上存在很大差异,HA和NA在假病毒水平上存在相互作用的可能,其具体机制还需要进一步的研究。胰酶处理增强了原先不能感染的H3和H4假病毒的感染性。我们对于构建的假病毒通过以下三种方法进行了验证,电镜下能观察到完整的病毒粒子形态,免疫印迹结果表明HA均掺入相应的假病毒,血凝试验表明掺入假病毒的HA具有生物学活性。最后,用H1、H3、H5和H7假病毒与相应抗体进行了假病毒中和试验,结果表明H1、H3、H5、H7(?)病毒可被相应抗体中和,初步说明我们所构建的假病毒可用于中和抗体的检测和评价。二、甲型流感病毒H1亚型特异性保守表位的鉴定和应用用H1N1甲型流感(H1N1pdm)病毒HA蛋白胞外区的合成肽库和H1N1甲流病人恢复期血清进行肽扫描分析,成功鉴定了五条免疫优势肽,分别是P3(38-52aa)、 P5(58-72aa)、P15(158-172aa)、P16(168-182aa)和P31(318-332aa)。除P15外,其余四条合成肽偶联物在小鼠中诱导出较强的抗体滴度,免疫印迹和ELISA试验表明P3、P5和P31三条肽含有HlNlpdm病毒的优势表位。进一步的免疫印迹分析表明P5和P31只与H1亚型HA蛋白反应,且与多个不同年代来源的H1亚型HA均反应，，说明P5和P31为H1亚型保守的特异性表位。。氨基酸序列比对分析和In silico保守性分析表明P5表位在H1亚型HA中高度保守,但在H2～H16HA中儿乎不存在。P5表位是一个从未被报道的线性表位,它位于传统的五个抗原位点区之外。以此表位作为抗原建立的合成肽ELISA方法与传统的血凝抑制试验相比具有很高的相关性(X2=58.01,P<0.01)。两种方法的一致性为87%,以血凝抑制试验作为标准方法,合成肽ELISA的灵敏度和特异性分别为96.5%和74.4%。综上所述,本研究首次建立了可涵盖甲型流感病毒已知的16个HA亚型及9个NA亚型的假病毒系统,并在假病毒水平上提示了HA和NA存在相互作用的可能；利用合成肽扫描技术首次发现一个H1亚型特异且高度保守的线性表位,利用该表位建立了H1亚型抗体检测技术,这些结果为发展流感病毒的有效监测和检测提供了基础和手段。