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皮肤作为人体最大的器官，是机体与外界的屏障，它具复杂的组织结构和许多重要的生理功能。皮肤严重损伤，将引起一系列严重并发症。皮肤损伤修复常用的方法有自体皮移植、同种异体皮移植、异种皮移植。大量临床实践表明，皮肤移植后瘢痕的增生程度与移植皮肤的真皮厚度成反比。因此皮肤缺损的修复要求移植的皮肤应有一定厚度的真皮组织，最好是采用全厚皮片移植或皮瓣移植。但对大面积皮肤缺损(如烧伤)患者来说，由于自体供皮区有限，而不可能采用全厚皮片或皮瓣移植修复所有创面，因此，寻找理想的皮肤替代物一直是临床上亟待解决的难题。随着组织工程学的兴起和发展，组织工程化皮肤为皮肤缺损的修复带来了希望。 自1975年Rheinwald和Green成功地建立了表皮细胞培养方法以后，经过不断技术改进，不仅将培养的表皮细胞膜片应用于临床取得成功，而且与各种真皮替代物一起构成复合皮取得一定进展，已经正式商品化、产业化的组织工程化皮肤也不断出现，并在临床应用中取得满意效果。尽管如此，仍然存在着许多问题，如真皮基质的来源，抗原性去除，角质形成细胞培养的稳定性，复合皮的血管构筑和生长调控等。因此，有必要对组织工程化皮肤进行深入研究。 [目的] 本实验根据猪的皮肤组织和人皮肤组织在结构和功能上的相似性，用低浓度胰蛋白酶消化加反复冻融法制备脱细胞异种(猪)真皮基质；构建血小板衍化生长因子(PDGF)真核表达重组质粒，转染成纤维细胞；在脱细胞异种(猪)真皮基质上培养角质形成细胞、PDGF基因转染的成纤维细胞来构建基因复合皮，从而深入研究组织工程化皮肤的构建。 [方法] 1．将断层猪皮浸入0.05％胰蛋白酶溶液中4℃过夜消化，无菌条件下揭去表皮，剩下的真皮在PBS溶液中持续震荡洗涤，再用同样浓度的胰蛋白酶消化(37℃，1h)，PBS溶液洗涤。然后依次行4℃预冷、—70℃冷冻各2h，再37℃下融化，如此反复冻融3次。进行免疫组化检测、细菌培养试验、细胞毒性试验、大鼠皮下埋植实验。 2．将出生24h内的SD大鼠消毒后PBS清洗，切取全厚皮片。用D-Hanks液新鲜配制的0.01％的胰蛋白酶溶液4℃下酶解18～24h。轻轻刮取真皮表皮面和表皮真皮面的角质形成细胞，密度梯度离心(DGC)分离纯化角质形成细胞，然后在含有添加第二军医大学憾士学位论文中文摘要剂和胎牛血清的FAD培养基中培养。相差显微镜观察，MTT法绘制角质形成细胞生长曲线，AO荧光染色、FCM检测。 3.从原代培养的人脐静脉内皮细胞中提取总RNA，通过逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出hPDGF一B目的DNA片段。通过连接酶连入真核质粒PcDNA3 .1中，经大肠杆菌DH5a扩增和筛选，构建出重组真核质粒PcDNA3.l一hPDGF一，进行鉴定。然后转染成纤维细胞，进行表达检测。 4.利用己制备的脱细胞异种(猪)真皮基质、培养的角质形成细胞和PDGF基因转染的成纤维细胞构建三种类型复合皮:A型，培养的角质形成细胞+脱细胞猪真皮基质(CK+AX);B型，培养的角质形成细胞+脱细胞猪真皮基质+培养的成纤维细胞(CK+AX+Fb):C型，培养的角质形成细胞+脱细胞猪真皮基质+P DGF基因转染的成纤维细胞(CK+AX十P几)。通过相差显微镜观察、组织切片HE染色、Pancytokeratin、Laminin和W型胶原免疫组化染色等方法进行检测。分别将三型复合皮分成A、B、C三组，进行动物移植实验，观察皮片存活率、创面收缩率、真皮血管化程度等，与单纯角质形成细胞膜片移植组(D组)和用凡士林纱布覆盖的对照组(E组)进行比较。 【结果】 1.制备好的脱细胞异种(猪)真皮基质呈瓷白色，表面(乳头层侧)平整光滑，有皮肤纹理起伏感，当中有均匀分布的天然毛孔，质地柔软有弹性，光镜下显示表皮已完全去除，真皮表面光滑完整，上有基底膜，其下为规则排列的胶原纤维，真皮基质内未见任何细胞成分、毛囊和皮脂腺等皮肤附件及血管存在。扫描电镜显示，真皮乳头突起和皮钉凹陷呈现规律的凹凸不平，未见表皮基底细胞附着于基底膜。透射电镜显示真皮乳头层表面可见基底膜结构清晰、连续而完整，胶原纤维排列致密有序。培养无细菌生长，无细胞毒性，大鼠皮下埋植生长良好。 2.角质形成细胞接种到培养瓶中后，倒置显微镜下观察呈悬浮微球状，约6h后，细胞沉降，开始贴壁，这时细胞形状为椭圆形，伪足少或无，随着时间推移，细胞形态变大，伪足增多，呈多角形，两两相连。2~3d后即可见大量的角质形成细胞贴壁生长，贴壁的角质形成细胞镜下呈多角形，可见多个伪足。细胞3一5d融合，胞体较大，有一个较大的卵圆形核，染色质颗粒细小而稀少，核着色浅，有的可见核仁。5~7d可见细胞分层。AO荧光染色显示活细胞百分率为97%。MTT法和FCM检测细胞生长良好。 3.重组质粒通过Ba浏印和托ndm酶切后，电泳图示o.6kb的h一PDGF一B的目的 一2-第二军医大学博士学位论文甲丈掏要片段和5.skb的载体片段，证明重组质