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背景：精神分裂症认知功能损害的研究已有百年的历史,20世纪70年代初Gallhofer首先提出精神分裂症除了阳性症状和阴性症状外,还存在第三类核心症状成分,即认知功能损害。认知功能是人脑通过感知觉、记忆和思维等过程反映客观事物特征、联系或关系的过程,即识别和恰当处理复杂任务(信息的接受、编码、储存、提取和使用)的能力。通常认为,精神分裂症患者的认知功能损害涉及到大脑的颞叶、额叶以及与其紧密相连的皮层下区。精神分裂症认知功能损害的发生率至少为40%-60%,临床主要表现为：注意障碍、记忆损害、执行功能障碍。精神分裂症认知功能损害的程度与其社会功能和职业功能关系密切,是精神分裂症患者能否回归社会的关键因素。在最近的几十年里,关于精神分裂症认知功能的研究主要集中于与前额叶皮质相关的执行功能,包括注意、计划、排序、决策、启动和行为抑制等方面。在临床上主要表现为解决问题的能力下降,言语流畅度降低,以及工作记忆(是指在执行认知任务过程中,用于信息的暂时存储和加工的资源有限的系统)受损。但是,越来越多的研究发现,额叶的功能障碍并不能完全解释精神分裂症的认知损害,具体来说：首先,执行功能障碍并不是精神分裂症的特异性症状,例如,在抑郁症、强迫症以及注意缺陷等疾病中均证实了执行功能障碍的存在；其次,记忆障碍并不是注意障碍或者执行功能障碍的继发损害,有研究表明,改善注意力对精神分裂症长时程记忆的自由回忆(free recall)改善作用甚微,同时在关于分裂症长时程和短时程的情节记忆(episodic memory)和语义记忆(semantic memory)的研究中发现,注意障碍和工作记忆障碍对长时程记忆无显著性影响；此外,亦无有力证据说明精神分裂症的记忆障碍与智力障碍存在关联。因此,与颞叶相关的长时程记忆障碍在精神分裂症的认知功能障碍中,与注意障碍、执行功能具有同样重要的地位。不同类型的记忆在脑内的具有不同的解剖学回路。与陈述性长时记忆相关的脑网络由三部分组成,分别是颞叶内侧,颞叶皮层和额叶皮质。虽然显性长时记忆最终的存储位置在大脑皮层,颞叶内侧却对记忆存储起到了决定性的作用,特别是海马,是学习记忆功能的重要脑区,被认为是形成长时记忆的重要部位。大量研究发现,精神分裂症患者记忆障碍与内侧颞叶损伤患者的记忆障碍类似,甚至有学者提出“分裂样痴呆”的概念,支持内侧颞叶是分裂症长时程记忆障碍的理论依据主要有二：首先,精神分裂症患者记忆信息的登录功能存在明显障碍,而记忆信息的存储和提取功能相对完好,许多学者认为登录过程的受损是精神分裂症记忆障碍的核心问题,而这类病患记忆信息的存储和提取似乎对长时程情节记忆无影响；其次,精神分裂症外显性记忆(亦称陈述记忆,包括情节记忆和语义记忆)明显受损,而内隐性记忆(亦称程序记忆,指不依赖意识或认知的关于技术、过程、或者“如何做”的记忆)相对保持完好。研究表明,大脑中的海马结构及相邻的皮层组织对外显记忆至关重要。可见,海马在分裂症记忆障碍的病理机制中的起着重要作用。2003年至今,我们根据《灵枢·卫气失常第五十九》记载：”肾生骨髓,诸髓皆属于脑,脑为髓之海,肾虚则脑病生”；《素问五脏生成篇》里也提到“头痛癫疾,下虚上实,过在足少阴、巨阳,甚则入肾。”的中医理论选方,并根据现代制药工艺,依照相应的质量控制标准提取制备的“补肾壮阳胶囊(曾用名思康达胶囊/Warming-Supplementing Kidney Yang (WSKY)) ",具有益肾补髓,健脾益智的功效。我们前期的研究结果显示,WSKY与维思通联用,能显著改善精神分裂症患者的认知功能和社会功能,提高慢性精神分裂症患者的生活质量,同时其安全性较高。因此,进一步深入探讨补肾壮阳胶囊改善精神分裂症认知功能的作用及其可能分子机制具有重要意义。鉴于海马在精神分裂症记忆障碍中的重要地位,在本研究中,我们着重探讨了WSKY对精神分裂症大鼠模型中与海马相关的长时程空间记忆障碍的影响,结果表明,WSKY可促进分裂症模型大鼠长时程记忆的形成,量效关系呈倒“U”形。同时,为了深入研究WSKY对分裂症长时程记忆作用的分子机制,我们探讨了WSKY对海马神经元中与长时程记忆相关蛋白表达的影响：一、脑源性神经营养因子(BDNF),作为神经营养因子家族中的重要一员,BDNF在大脑中分布广泛,对神经元的生长、发育、分化其着重要作用,BDNF与其高亲和力受体TrKB结合,能显著促进海马神经元LTP,通过影响活性依赖的突触可塑性,在学习和记忆功能的形成和维持中起着举足轻重的作用。二、cAMP反应原件结合蛋白(CREB),作为重要的转录调节因子,CREB的功能表现在生命活动的许多方面,其中与学习记忆分子神经机制相关的功能尤为引人注意,早期研究表明,抑制CREB可以阻断果蝇长时程记忆的形成,反之,促进CREB的表达,则可促进长时程记忆的形成。CREB对长时程记忆的影响与其调节转录的作用密切相关,磷酸化后的CREB可增强多种靶基因的表达,形成新的突触联系,为长时程记忆的形成提供结构基础。同时,在小鼠中观察到,海马区长时程记忆增强是转录依赖性的,可见,CREB作为共价修饰短期过程到转录依赖的长期过程的枢纽,对长时程记忆的形成具有举足轻重的作用。在本研究中,WSKY促进了海马神经元BDNF的表达,并上调了CREB的磷酸化,在学习记忆的分子机制中,神经活动导致钙离子内流增加,进而激活胞内的信号转导,MAPK/ERK、CaMIV和PKA等均可激活CREB,而BDNF与其高亲和力受体TrkB结合后,主要通过激活ERK/CREB途径来完成对记忆的促进作用,有研究证明BDNF/ERK/CREB在海马长时程空间记忆的形成具有重要意义。因此,我们进一步探讨了ERK1/2在WSKY分子机制中的作用,发现WSKY对CREB的活化作用主要通过上调ERK1/2的磷酸化来完成。鉴于以上结果,我们推论：WSKY对精神分裂症模型大鼠的长时程记忆具有一定的改善作用,这一作用与上调BDNF表达以及激活其下游信号转导通路有关。第一部分WSKY对精神分裂症模型大鼠长时程记忆及海马区BDNF表达的影响目的：1、利用HPLC对WSKY进行初步的有效成分分析和鉴定。2、建立精神分裂症大鼠模型。3、观察WSKY对精神分裂症模型大鼠长时程记忆能力的影响。4、观察WSKY对精神分裂症模型大鼠海马区BDNF表达的影响。方法：按照前期实验中优化的制作工艺和质量控制方案制作WSKY,并利用HPLC初步分析和鉴定WSKY主要有效成分；将60只体重100±5的未成年雄性SD大鼠随机分为6组：模型组以MK-801 (0.05mg/kg)连续腹腔注射14天(1次/天),利用旷场实验、强迫游泳试验以及Morris水迷宫检测检验模型；对照组予以等量生理盐水；WSKY处理组在腹腔注射MK-801前2h给予WSKY口服,分为：WSKY25+MK-801组,WSKY100+MK-801组,WSKY250+MK-801组和WSKY500+MK-801组(mg/kg, W/W),口服给药14天。在9-14天,利用Morris水迷宫实验测查WSKY对大鼠长时程记忆的影响,记录指标包括定位航行实验中的逃逸时间和游泳速度,以及巡航试验中穿越原平台位置的次数和在目标象限停留时间；在行为学结束后,以免疫组织化学法检测WSKY对大鼠海马中BDNF表达的影响。结果：1、HPLC分析和鉴定：经过工艺改良和质量控制,WSKY的稳定性符合后期实验的要求,其主要成分包括：淫羊藿苷、党参炔苷、黄芪总皂苷、桂皮醛、橙皮苷、乌头碱等物质。2、旷场实验结果：末次MK-801腹腔注射30分钟后,模型组和对照组在旷场实验中自发活动总路程无显著性差异(P>0.05),模型组与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。3、强迫游泳试验结果：末次MK-801腹腔注射30分钟后,和对照组相比,模型组不动时间显著延长(P<0.05)。4、Morris水迷宫检测结果：(1)MK-801腹腔注射2周后,模型组和对照相比,两组大鼠游泳速度无显著性差异(P>0.05),定位航行实验期间模型组逃逸时间较对照组明显延长(F1,23=502.759,P<0.001),随着训练次数增加,模型组的逃逸时间亦可以逐渐缩短(F4,115=37.14,P<0.01)。(2)定位航行期间,处理组与对照组及模型组相比,游泳速度均无明显差异(P>0.05); WSKY25+MK-801, WSKY100+MK-801, WSKY250+MK-801三组训练期逃逸时间较模型组显著缩短(WSKY25+MK-801组,F1,27=10.248,P<0.05；WSKY100+MK-801组,F1,27=206.159,P<0.01; WSKY+MK-801组,F1,27=273.908,P<0.01,分别和模型组相比),而WSKY500+MK-801处理组,逃逸时间与模型组无明显差异。(3)巡航试验中,和模型组相比,WSKY100+MK-801组和WSKY250+MK-801组在目标象限停留时间显著延长(WSKY100+MK-801组：29.1±4.9vs.模型组：21.5±2.5,p=0.039,p<0.05；WSKY250+MK-801组：32..31±3.65vs.模型组：21.5±2.5,p=0.002,p<0.01),而仅有WSKY250+MK-801组穿越平台区域的次数增加[WSKY250+MK-801:2.33± 0.58vs模型组：0.67±0.58,p<0.01)。5、免疫组化：与对照组相比,模型组海马CA1区(p<0.01)及DG(p<0.01)BDNF表达明显下降；和模型组相比,WSKY250+MK-801组DG区BDNF表达量显著增加(p<0.01),而CA1区有上升趋势,但无显著性差异(P>0.05)。结论：1、WSKY的稳定性符合后期实验的要求,主要成分分析为后期实验药理机制的探究提供基础。2、利用低剂量MK-801 (0.05mg/Kg)连续腹腔注射14天使大鼠自主活动未见明显增加,阴性症状明显,运动功能未受损,而长时程空间记忆明显受损,说明该谷氨酸能低下的精神分裂症认知损害模型有效。3、经不同剂量WSKY处理后,大鼠运动功能未受影响,部分剂量组模型大鼠长时程记忆改善,量效关系呈倒“U”形。4、促进海马DG区中神经元BDNF的表达,是WSKY改善长时程记忆的可能的分子机制之一。第二部分WSKY对海马神经元BDNF及其信号转导途径的影响目的：1、利用WSKY含药血清处理大鼠海马神经元,探讨WSKY对海马神经元中BDNF/ERK/CREB信号通路的影响。2、观察WSKY对正常未成年大鼠海马区BDNF/ERK/CREB信号转导途径的影响。方法：体外部分：(1)取16-18天的SD胎鼠海马,进行海马神经元的培养、纯化和鉴定。(2)以WSKY250mg/Kg|口服给药未成年大鼠,2次/日,5次给药后1h,麻醉后腹主动脉取血,静置,离心取血清,灭活,过滤除菌后,-80℃C冻存备用。(3)实验分组：5%空白血清组、10%空白血清组、15%空白血清组,5%含药血清组、10%含药血清组、15%含药血清组,空白对照组(无血清培养)。(4) WesternB lotting法检测海马神经元proBDNF、BDNF、ERK1/2、pERK1/2、CREB、pCREB的蛋白表达变化,并分析PKA抑制剂H-89以及MEK抑制剂U-0126处理细胞后,ERK及CREB的活性及表达的情况。体内部分：(1)18只未成年健康SD大鼠随机分为WSKY处理组(分别予以WSKY100mg/kg、250mg/kg)和对照组(予以等量生理盐水)口服给药2周,1次/日,末次给药后2h取大鼠海马,WesternB lotting法检测海马区BDNF、ERK1/2、 pERK1/2、CREB、pCREB等的表达变化。结果：体外试验结果：(1)和对照组相比,各血清组均明显增加了proBDNF(p<0.01)和natureBDNF (p< 0.01)的表达；和各浓度空白血清组相比,WSKY含药血清组对proBDNF的表达无显著性差异(P>0.05),但对BDNF的表达有显著的促进作用(p<0.01)。(2)与对照组相比,WSKY含药血清对ERK(P>0.05)和CREB(P>0.05)的表达无明显影响,但是WSKY含药血清处理与磷酸化ERK1/2(p<0.01)和磷酸化CREB (p<0.01)的表达增加具有显著性相关。且这种促进作用能够被MEK抑制剂U-0126的预处理所完全阻断(p<0.01),而PKA抑制剂H-89则无完全阻断作用(P>0.05)。体内实验结果：WSKY100组与VSKY250组大鼠海马区proBDNF表达明显增加(p<0.01),同时促进磷酸化ERK (p<0.01)和磷酸化CREB (p<0.01)表达水平的增加。结论：WSKY能促进海马神经元中BDNF的表达,WSKY对分裂症大鼠长时程记忆的改善作用,可能与促进BDNF的表达以及激活BDNF/ERK/CREB信号转导途径有关。