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作者实验室培育的异源四倍体鲫鲤品系,目前繁殖到了第25代,该品系两性可育且遗传性状稳定,为鱼类遗传育种和生物进化研究提供了非常好的实验材料。异源四倍体鲫鲤(AT)与二倍体红鲫(Carassius auratusred var.,RCC)倍间交配,研制出了异源三倍体鲫鱼(TCC)。异源三倍体鲫鱼因其性腺败育,不会影响自然界的种质资源,因此具有在任何水域养殖的潜力,加上这种三倍体鱼的生长速度快、抗病性强,应用前景相当广阔。microRNA(miRNA)即长度约为22个核苷酸的微小RNA,是真核生物中一类内源性的非编码小分子RNA。研究发现,miRNA能够引起靶基因mRNA的降解或抑制其翻译,来对基因表达进行转录后调控,而这都是通过其与靶基因mRNA特异性的碱基配对结合来实现的。越来越多的研究表明,miRNA涉及的生命活动非常广泛,与器官形成、胚胎发育、肿瘤发生以及细胞的增殖、分化、凋亡等均有密切的关系。而下丘脑-垂体-性腺(Hypothalamus-Pituitary-Gonad axis,HPG 轴)在鱼类的性腺发育中也相当重要,Kisspeptin,是由kiss基因编码的神经内分泌多肽激素,对HPG轴具有调控作用。在本论文中,我们建立了红鲫、异源三倍体鲫鱼、异源四倍体鲫鲤精巢的miRNA文库并对文库开展了生物信息分析及相关实验验证,同时对kiss基因mRNA在这3种鱼中的表达进行了比较研究。研究结果将会对三倍体鱼不育原因的探究有重要意义,同时也有助于人们系统的研究脊椎动物的生殖和发育。1.分别对3个红鲫的精巢组织样本(RC1、RC2、RC3)、3个异源三倍体鲫鱼精巢组织样本(TC1、TC2、TC3)和3个异源四倍体鲫鲤的精巢组织样本(AT1、AT2、AT3)进行了高通量测序,经质量评估和长度筛选后最终获得的sRNA的clean reads分别为:9,072,963条5,170,431种(RC1);8,189,738条4,391,085种(RC2);8,579,897条4,608,008种(RC3);9,448,066条5,522,231 种(TC1);9,364,165条5,940,300种(TC2);9,082,507条5,649,978种(TC3);10,232,739条5,147,281 种(AT1);9,431,584条5,315,216种(AT2);9,910,677条4,994,043(AT3)。2.miRNA集中在21～22nt,通过对其长度比较得知,RC1的miRNA占sRNA的9.47%,RC2占7.69%,RC3占 12.86%,TC1 占 16.31%,TC2占7.43%,TC3占8.70%,AT1 占20.60%,AT2占 15.18%,AT3占26.01%。将得到的sRNA序列通过数据库比对以及生物信息学分析,进行了分类注释统计。结果显示,3种鱼9个样本中,143条已知miRNA序列被鉴别,122条新miRNA序列被预测到,并对它们的各位碱基的偏好性作了统计。3.利用Illumina HiSeq 2500测序平台分析不同倍性鲫鲤之间差异表达的miRNA发现:异源三倍体鲫鱼相对于红鲫显著上调的有41个,显著下调的有34个;相对于异源四倍体鲫鲤,显著上调的有53个,显著下调的有62个。其中,三倍体相对于二倍体和四倍体均显著上调的miRNA有17个,三倍体相对于二倍体和四倍体均显著下调的miRNA有30个,还有2个miRNA的表达随倍性的增加而增加。选取三倍体相对于四倍体和二倍体均上调的miRNA4个和均下调的miRNA5个,经qRT-PCR验证结果显示,有8个miRNA的高通量测序结果与验证结果在表达趋势上一致,但上调和下调的表达倍数不完全吻合。4.选取的有显著表达差异的miRNA经生物信息学分析进行靶基因预测发现,经qRT-PCR验证的其中有些miRNA与精子鞭毛装配和运动相关基因以及影响精巢中细胞的分化的基因有关,且在不同倍性鱼间,miRNA表达的趋势与这些基因表达的趋势正好相反,进一步证明了文库的可信度。这些miRNA能够调控三倍体鱼中这类基因的mRNA降解或翻译抑制的程度相对于红鲫和异源四倍体鲫鲤有显著差别,从而使精子鞭毛形成受阻、运动异常,精巢中细胞的分化失败,最终导致三倍体鱼雄性不育。5.对红鲫、异源三倍体鲫鱼以及异源四倍体鲫鲤两个kiss基因(kiss1和kiss2)的部分cDNA序列进行了克隆及序列分析,并对其在红鲫、异源三倍体鲫鱼和异源四倍体鲫鲤9种组织中的差异性表达进行了研究和分析。