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硒是人和动物所必需的微量元素,在地表分布的不均一已导致了生态环境的健康效应,如湖北恩施和陕西紫阳的人群硒中毒等。渔塘坝是湖北恩施较为典型的高硒地区之一,广泛出露的富硒碳质岩在恩施州形成分布面积约两千多平方公里的高硒土壤。有关硒的环境地球化学已经进行了较为深入的研究,而高硒地区硒的微生物地球化学研究在国内尚未开展。由于硒的生物地球化学循环主要受着微生物的控制,因此,对高硒环境中与硒相关的微生物进行研究,不仅可以进一步了解高硒环境下微生物在硒微生物地球化学转化过程中的重要作用,完善硒的生物地球化学循环,而且能够为硒污染的生态系统生物修复提供了科学的依据和技术支撑。本研究以恩施渔塘坝地区发育的高硒碳质泥岩为研究对象,利用现代分子生态学方法,包括高硒泥岩样品中的总DNA提取、PCR扩增、16S rDNA文库的构建、16s rDNA限制性内切酶多态性(RFLP)分析、基于16S rDNA克隆子序列的系统进化分析,以及二维双向电泳、Fosmid宏基因文库构建等,对其微生物群落结构及硒的细菌还原进行了研究,探讨了微生物在硒的微生物地球化学循环中的作用及可能的机制。取得了以下几个方面的主要认识:
1.测定了湖北恩施渔塘坝富硒碳质泥岩样品的基本化学参数如pH、总碳、有机碳、以及硒和其他微量元素等。结果表明,样品呈酸性,pH范围为4.5～5.9；总碳含量为6.1％～19.4％之间；富含有机碳,含量为5.2％～19.5％。样品中硒含量的变化范围较大16.7mg/kg～5522.5 mg/kg。
2.优化了针对高硒泥岩的DNA提取方法,并采用16SrDNA文库构建与RFLP指纹图谱技术,对湖北恩施渔塘坝富硒泥岩中的微生物群落结构进行了研究,结果显示:古菌克隆文库中有40个克隆属于泉古菌(Crenarchaeota),所占克隆文库比例为66.67％;此外还有广古菌(Euryarchaeota):1.67％,以及未分类古菌(Unclassified darchaea):31.67％。细菌克隆文库中有56个克隆属于变形细菌门(Proteobacteria),所占克隆文库比例为34％。其中α-Proteobacteri,β-Proteobacteria,γ-Proteobacteria,δ-Proteobacteria所占比例分别为:3.68％,25.15％,3.07％,1.23％。除变形细菌门(Proteobacteria)序列以外还得到包括酸杆菌门(Acidobacteria):43.56％；放线菌门(Actinobacteria):12.88％；浮霉菌门(Planctomycetes):4.91％；壁厚菌门(Firmicutes):0.61％；绿弯菌门(Chloroflexi)；0.61％；以及未分类细菌(Unclassified bacteria):3.07％。共11个种类。证实样品中微生物多样性丰富有着很多未被培养且尚未被认识的微生物类群具有开发潜能。根据细菌和古菌克隆子文库的多样性稀释曲线可知,湖北恩施渔塘坝的古菌文库,细菌文库,均未达到饱和,由评价文库质量的指标:Shannon-Weaver和Simpson指数可知:细菌文库的丰度和均匀度均优于古菌文库,因此,细菌文库的多样性要比古菌文库高。
3.采用邻接法分别构建了湖北恩施渔塘坝富硒碳质泥岩样品中古菌、低硒细菌、高硒细菌、真核微生物系统发育树,发现其中低硒、高硒系统发育树差别不大,说明样品中的微生物种群是由低硒环境慢慢向高硒环境适应的过程,大多数样品中的微生物最初应该来自于土壤环境,随时间的推移慢慢适应了高硒环境,演化出能够将有毒的硒氧化物还原为硒单质排出体外的机制,这也是一个生物与地球相互作用共同演化的实例。
4.采用富集驯化培养和稀释培养的方法,对样品中的硒酸盐还原菌、亚硒酸盐还原菌进行了筛选并获得了6株高效还原硒氧化物产生红色硒单质纳米颗粒的菌株,选择其中还原效率较高,生长迅速的菌株做了进一步模拟实验,发现这株菌兼性好氧,革兰氏阳性,端生鞭毛并初步鉴定为地衣芽胞杆菌,并采用透射电镜对还原硒酸盐、亚硒酸盐的菌株进行了观察,发现球状颗粒在菌体表面附着直径50～200nm；经能谱仪检测主要成分为纯硒。
5.富集驯化得到的菌株都具有将硒酸盐、亚硒酸盐高效还原为硒单质颗粒的能力,而部分菌株还观察到可以产生气体(甲基硒化物)于血清瓶内气相中,菌株SeRB-1能够高效的将具有毒性和高生物可利用性的硒氧化物还原为无毒不可溶于水的红色单质硒纳米颗粒,从而降低生物毒害,因此对于高硒污染的土壤及水体都可以起到生物修复的作用。此外,生成的硒单质颗粒二次沉降后有可能形成生物成因的硒矿床。摸索了硒还原菌株全蛋白的提取方法及2D电泳技术,并构建了硒还原菌株的宏基因组文库可以从蛋白质组和基因组方面为进一步的机理研究提供了研究基础。
该项研究丰富了对高硒环境中的微生物群落结构的认识,同时也为高硒环境中硒的微生物修复技术提供了科学依据,为进一步认识高硒环境中硒的微生物地球化学过程中微生物作用提供了参考依据,并可以为国内高硒区中硒或其它受各种金属元素污染地区的微生物地球化学研究提供范例。