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目的:研究生长抑制因子4基因(inhibitor of growth4,ING4)抑制脑胶质瘤细胞增殖的作用,探讨其可能的作用机制。
方法:在QBI-293A细胞中扩增已构建的重组腺病毒Adenovirus(Ad):Ad-ING4,标记了示踪基因GFP(Green Fluorescent Protein)的Ad-ING4-GFP,以及标记了β-半乳糖苷酶基因Z(β-galactosidase gene Z,lacZ)作为对照的空腺病毒Ad-lacZ和Ad-GFP；重组腺病毒转染U251细胞,荧光显微镜观察带有GFP的重组腺病毒的ING4表达情况；RT-PCR检测ING4的转录水平；MTT法检测重组腺病毒导入的ING4对U251细胞增殖的影响；流式检测重组腺病毒对细胞周期的影响；Hoechst33342染色观察细胞核变化；MDC染色观察自噬小泡的形成,再进行流式细胞仪定量分析；western blot检测自噬通路相关蛋白LC3、Beclin-1蛋白表达量及凋亡自噬通路相关蛋白Bax,Bcl-2,caspase-8,9,3的蛋白表达量；用自噬特异性抑制剂3-MA阻断自噬后检测ING4对肿瘤细胞抑制率的变化；DCFH-DA染色检测活性氧(ROS)生成；JC-1染色检测线粒体膜电位。
结果:重组在QBI-293A细胞中扩增,并可转染U251细胞,ING4基因在U251细胞中得到表达。Ad-ING4和Ad-ING4-GFP能够有效的抑制肿瘤细胞的增殖,而作为对照组的腺病毒Ad-lacZ和Ad-GFP对肿瘤细胞增殖没有影响。Ad-ING4处理U251后,细胞周期阻滞在S期。Ad-ING4处理诱导U251细胞发生凋亡和自噬:细胞核皱缩及片段化；细胞产生自噬小泡,LC3蛋白表达增加并且活化,Beclin-1蛋白表达增加。Ad—ING4作用24h后上调Bcl-2,Bax和Beclin-1水平,而在48 h和72 h后分别下调Bax和Bcl-2水平；Ad-ING4作用24 h后可激活caspase-3、9,抑制caspase-8；用自噬抑制剂3-MA预处理细胞发现当自噬被抑制之后,细胞的存活率升高,表明自噬促进了细胞的死亡。Ad-ING4可诱导U251细胞线粒体膜电位下降,PTP孔道开放,ROS含量升高。
结论:Ad-ING4可抑制U251细胞增殖并且诱导其发生凋亡和自噬,其机制可能是与Ad-ING4诱导U251线粒体膜电位下降和细胞内ROS的增加,导致线粒体依赖的凋亡和自噬有关。总之,ING4是一个值得进一步研究的抑癌基因。