体外兔髓核细胞培养及hIGF-1对兔椎间盘髓核细胞凋亡的影响

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背景:椎间盘退变是引起下腰痛的重要原因之一,在退变的椎间盘中,髓核细胞大量凋亡。有研究发现,胰岛素样生长因子-1(IGF-1)有明显抑制软骨细胞凋亡的作用,表明IGF-1可能会有抑制类软骨细胞—髓核细胞凋亡的作用。  目的:本实验通过建立家兔椎间盘髓核细胞体外培养模型,利用白介素-1(IL-1)诱导培养的家兔椎间盘髓核细胞凋亡,用 IGF-1对凋亡模型进行干预,探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对髓核细胞凋亡的抑制作用,揭示其抗凋亡作用机制,为IGF-1防治椎间盘退变提供理论依据。  方法:1.从健康家兔取出椎间盘髓核,用Ⅱ型胶原酶消化法分离原代椎间盘髓核细胞后,单层培养并以胰酶消化法传代,采用差速贴壁法进行纯化。2.采用Ⅱ型胶原免疫组织化学染色、甲苯胺蓝染色对髓核细胞进行鉴定。3.按空白组、IGF-1组(IGF-1、IL-1两种细胞因子共同作用)和IL-1组(仅IL-1因子作用)进行分组处理。4.利用光学显微镜、Giemsa染色、原位末端标记(TUNEL)技术进行观察,以 Annexin-v/PI双染细胞后,用流式细胞仪测定的各组髓核细胞早期和晚期凋亡率作为凋亡检测指标。  结果:1.IL-1组光镜下可见大量髓核细胞凋亡,并可见典型的细胞凋亡形态学改变, IGF-1组可见少量细胞凋亡,空白组罕见凋亡征象。2.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性,甲苯胺蓝染色呈异染性。3.原位末端标记显示:空白组凋亡率为(0.45±0.06),IL-1组凋亡率为(17.80±5.11),IGF-1组凋亡率为(6.11±1.39)。与IL-1组比较, IGF-1组细胞凋亡率明显降低,差异有显著性(P<0.01);与空白组比较, IL-1组细胞凋亡率明显增加,差异有显著性(P<0.01)。4.流式细胞仪检测显示:空白组早期凋亡率为(0.49±0.05),晚期凋亡率为(0.21±0.06);IL-1组早期凋亡率为(22.16±2.69),晚期凋亡率为(12.98±2.02);IGF-1组早期凋亡率为(5.03±0.96),晚期凋亡率为(7.98±1.37)。与IL-1组比较, IGF-1组细胞早期和晚期凋亡率都明显降低,差异均有显著性(P<0.01)。与空白组比较,IL-1组早期和晚期凋亡率都明显增高,差异均有显著性(P<0.01)。  结论:1.本研究建立了简单易行的髓核细胞分离、培养方法;原代、第二代细胞生长良好,表型稳定,适合于实验研究,髓核细胞四代培养后,细胞表型发生改变。2. IL-1可以诱导体外培养的髓核细胞凋亡。3. IGF-1对IL-1体外诱导的髓核细胞凋亡具有抑制作用。
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