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植物能感知、传递逆境胁迫信号,诱导相关功能的基因表达,在生理生化上作出适应性响应。转录因子在信号的传递、相关功能基因的表达调控以及发育阶段的调控中起着重要的作用。Sakuma等人将拟南芥中的145个AP2/EREBP转录因子分成5类:AP2类(14 genes),RAV类(6 genes),DREB类(即CBF,56 genes),ERF类(即EREBP,65 genes)和其它(4 genes)。其中,DREB和ERF类转录因子可能参与了生物胁迫和非生物胁迫响应。 DRE/CRT元件位于受干旱或低温调控的RD/COR(responsive to dehydration/cold-regulated)基因的启动子区,DREB转录因子通过结合DRE/CRT元件参与非生物胁迫响应;ERE元件位于抗病相关PR(pathogenesis-related)基因的启动子区,ERF转录因子可能通过与ERE元件的互作参与抗病性响应。 近年来,AP2/EREBP转录因子倍受重视,研究表明,DREB和ERF类转录因子可以用于改良农作物对生物胁迫和非生物胁迫的耐性。本实验旨在利用酵母单杂交和噬菌斑原位杂交的方法,克隆与抗逆相关的转录因子基因,并通过转基因技术获得小麦抗逆材料。对于小麦的抗逆育种以及阐述小麦耐受胁迫的分子机制都有着重要的意义。 本研究取得以下研究进展: 1.cDNA文库的构建:采用抗旱品种小白麦和耐盐品种茶淀红分别构建了小麦干旱诱导和高盐诱导的cDNA噬菌体文库,容量分别为3.6×10~6 pfu和3.0×10~6 pfu,插入片段大小多集中在0.7-2kb之间。 2.目的基因的克隆:用DREB/ERF转录因子保守域AP2片段做探针,采用噬菌体原位杂交技术筛选干旱诱导的小麦cDNA噬菌体文库,结合5’-RACE和RT-PCR的方法共克隆到10个DREB类转录因子基因(DREB2-11)和2个ERF类转录因子基因(ERF1-2)。根据氨基酸序列的同源性和序列的结构特征,将克隆到的10个DREB(DREB2-DREB11)基因分成5类,第Ⅰ类:DREB3、DREB4和DREB5;第Ⅱ类:W50、DREB6和DREB7与DREB1(Shen et al., 2003);第Ⅲ类:DREB2和DREB8;第Ⅳ类:DREB9和DREB10;第Ⅴ类:DREB11;ERF1和ERF2分别属于不同的两类基因,除了第Ⅱ类DREB基因外,其余均为未见报道的新基因。 3.基因结构分析:分析了克隆到的10个DREB和ERF基因(除DREB2和DREB8)的结构,结果表明,除了ERF2基因不含内含子外,其余9个基因(DREB3-7,DREB9-11和ERF1)均含有1-3个内含子。有趣的是,DREB4 cDNA序列对应两个不同形式的基因结构,一个大小1.2Kb左右,不含内含子,对应DREB4B cDNA序列,另一个大小3.5Kb左右,有4个外显子和3个内含子组成,推测可能存在3种不同的剪辑方式从而形成了3种不同的cDNA: DREB4A、DREB4B和DREB4C。 4.表达特性分析:Northern blot试验结果表明DREB4基因的转录依赖于ABA,受干旱、高盐的诱导,低温也微弱地激活了DREB4基因的转录表达;ERF1基因受干旱和低温的强烈诱导,对ABA有微弱的响应,而ERF2基因的转录受干旱和高盐的强烈诱导,外源ABA在早期也