论文部分内容阅读
化学生物学是一个跨越生物学和化学的新兴前沿交叉学科，其主要的内涵是利用小分子化合物作为探针研究细胞的生命活动现象，从而揭示细胞生命活动的规律。目前，化学生物学方法已被广泛应用于细胞凋亡、分化、细胞周期调控、生长因子信号转导通路等方面的研究，并以此为基础，成功地开发了大量的药物或诊断试剂用于临床。通过本实验组建立的 NF-κB抑制剂的筛选平台，我们对多种人工合成的小分子化合物进行筛选，得到具有 NF-κB抑制效果的含硼小分子化合物ZW082。在此基础上，我们以ZW082为探针，开展血液系统恶性肿瘤的化学生物学研究，并取得如下研究成果：首先，ZW082具有抑制NF-κB的作用。ZW082对NF-κB信号通路的抑制作用不仅表现在细胞水平，在动物体内同样具有较显著的抑制NF-κB的作用。通过Real time-PCR实验，我们发现ZW082部分抑制NF-κB下游靶基因在转录水平的表达：在H929细胞中ZW082对IL-8、IκBα、A-20、c-myc、CD44等基因均有不同程度的抑制作用，在U266细胞中，ZW082对IL-8、IκBα、A-20、c-myc也具有抑制作用。通过EMSA实验，我们进一步证实，ZW082抑制NF-κB与DNA的结合。通过研究ZW082对多发性骨髓瘤细胞的作用发现：ZW082对MM1.3、RPMI8266、H929、U266等细胞株具有不同程度的生长抑制作用。这种生长抑制作用在H929细胞株中主要表现为周期阻滞，凋亡现象并不明显。在U266细胞中，ZW082表现为明显的诱导凋亡的作用，并且线粒体途径参与了该过程。为检测NF-κB信号通路与ZW082效应中的关系，我们在H929和U266细胞中分别敲除p65，结果发现：在H929细胞中，p65敲除的细胞与对照组相比凋亡现象增加不明显；在U266细胞中，p65敲除的细胞与对照组相比凋亡现象显著增加。这些结果提示ZW082可能是通过抑制 NF-κB信号通路诱导多发性骨髓瘤的凋亡。用1?M的ZW082处理H929细胞株后，再加入TNF-?诱导NF-κB信号通路活化，结果发现ZW082可抑制IκBα的磷酸化降解P65的核转位受到明显的抑制。在U266细胞中，ZW082也可以抑制IκBα的核转位。ZW082是一个含硼的小分子化合物。但是与临床上常用的治疗MM的蛋白酶体抑制剂硼替佐米不同，ZW082不是通过抑制蛋白酶体的活性，从而阻止IκBα的泛素化降解及NF-κB的活化。为进一步研究ZW082抑制NF-κB信号通路的分子机制，发现其作用的分子靶点，我们对ZW082分子进行了修饰，得到同样具有 NF-κB抑制效应的生物素标记（ZW662）和 Bodipy荧光标记（ZW673）的小分子化合物。我们发现荧光标记的ZW673主要定位在细胞浆。这一结果提示 ZW082的分子靶标可能在细胞浆内。此外，我们检测了ZW082对ATRA耐药急性早幼粒白血病细胞的作用，结果发现 ZW082能够克服 MR2细胞对ATRA的耐药性，促进细胞的分化。总之，我们发现，含硼小分子化合物ZW082可以通过抑制NF-κB信号通路诱导多发性骨髓瘤细胞增殖，促进其凋亡，并可克服MR2细胞对ATRA的耐药性。这为今后研究NF-κB信号通路的调节机制，发现新的作用靶点提供了先导化合物。