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小分子热休克蛋白是广泛存在于原核和真核生物中的一类分子伴侣。很多研究结果表明,小分子热休克蛋白与胁迫条件下细胞内蛋白的稳态和生存有着密切联系,但活细胞内小分子热休克蛋白的相互作用蛋白以及小分子热休克蛋白发挥分子伴侣活性的结构基础仍有待研究。本论文以两种小分子热休克蛋白作为模式蛋白分别对上述问题进行了探索。 首先,大肠杆菌(Escherichia coli)的IbpB(Inclusion-body binding protein)被作为模式蛋白来研究其在体内的相互作用蛋白。甲醛介导的化学交联和非天然氨基酸pBpa介导的光交联的分析结果表明,在大肠杆菌体内,IbpB在30℃和50℃条件下都结合客户蛋白,且N端结构域是IbpB负责客户蛋白结合的主要区域。通过串联质谱对IbpB体内甲醛交联产物和光交联产物的鉴定,一共124种在大肠杆菌体内和IbpB相互作用的蛋白被捕获,这些蛋白广泛地参与细胞内多种生物学活动,如糖代谢、蛋白质的合成与降解等。IbpB在非热胁迫及热胁迫条件下均可对捕获的部分客户蛋白发挥保护作用。最为重要的是,ATP依赖的分子伴侣DnaK被发现在大肠杆菌体内和IbpB存在相互作用,并可以在体内帮助IbpB释放其结合的部分客户蛋白。 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)的AgsA(Aggregation suppressing protein)被作为模式蛋白来研究其发挥分子伴侣活性的结构基础。在体外,AgsA于30℃时形成均一的大寡聚体,并且可以在此温度下阻止胰岛素在DTT诱导下发生的聚集。本论文主要借助冷冻电镜(Cryo-electron microscopy)对AgsA和AgsA-Insulin复合物的冷冻单颗粒进行三维重构来研究AgsA在低温下不通过解聚就发挥类分子伴侣活性的机制。研究结果表明,AgsA在室温下形成24个亚单位组成的笼状寡聚体,在一定的温度条件和部分变性客户蛋白的诱导之下,AgsA寡聚体以“四联体”为结构单元发生相对位移,导致AgsA寡聚体“膨胀”,从而在“四联体”之间产生巨大的空隙,而空隙的大小足以让部分变性的客户蛋白进入。最后,AgsA寡聚体将部分变性的客户蛋白包裹在寡聚体“腔”的中央来阻止客户蛋白的聚集。 本论文是首次在活细胞内研究小分子热休克蛋白相互作用蛋白的工作,揭示了分子伴侣系统在大肠杆菌体内通过形成网络来发挥功能。另外,本论文还是首次发现不经过寡聚体解聚发挥分子伴侣活性的小分子热休克蛋白,为小分子热休克蛋白发挥分子伴侣活性的机制提供了新的见解。