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急性肝功能衰竭发病急，病情十分严重，保守治疗效果不佳。肝细胞移植是治疗肝衰竭的行之有效的途径之一，异体的肝细胞是很好的种子细胞，但是异体肝细胞移植若不使用免疫抑制剂则面临着受体发生的急性免疫排斥反应。微囊技术是指由半透膜包被生物活性物质的一种结构，该结构可以阻遏免疫细胞以及引起免疫排斥反应的大分子抗体，同时允许氧气，营养物质和一些具有生物活性的小分子物质自由通透，因此微囊能为移植物提供有效的免疫保护，使其免受异体排斥反应。我们利用海藻酸钠制各海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(Alginate-Polylysine-Alginate，APA)和海藻酸钡-聚赖氨酸-海藻酸钠(Ba-alginate-Polylysine-Alginate，BPA)微囊，并对两种微囊的物理性能、生物相容性、微囊化细胞的功能发挥进行研究，然后体内移植BPA微囊化肝细胞和共包裹睾丸支持细胞与肝细胞治疗肝衰竭动物模型，旨在进一步改进微囊制作条件，提高微囊化肝细胞移植的治疗效果，为微囊化肝细胞移植的深入研究和向临床过渡提供理论依据。主要研究内容包括以下四个部分：一、微囊的制备及条件的优化通过调整静电液滴法制备微囊的多种影响因素，优化制备条件，根据不同移植物的要求制备不同粒径大小的微囊，成功制备大小均匀，囊壁光滑的微囊。用于包被肝细胞，本试验采用静电场为6kV／1.5cm，泵速度为15ml／h，针头内径为0.25mm，海藻酸钠浓度为2％，多聚赖氨酸浓度为0.05％，作用时间为6min，制备的微囊粒径为300-400μm。二、微囊的物理与生物学性能评价1．采用机械震荡实验测定不同类型微囊的机械强度和体外模拟体液长期培养测定不同类型微囊的渗透压强度，结果表明，BPA微囊比APA微囊具有较高的机械强度和长期稳定性。2．采用体内移植实验测定微囊在肌肉内的移植强度以及腹腔移植后的生物相容性，结果表明：APA微囊肌肉移植一个月后，可见多数微囊出现变形，明显膨胀，纤维化较明显，而BPA微囊仍然可以保持近似球形，且膨胀率不大，仅有轻度纤维化。微囊腹腔移植后，APA微囊的56天回收率为76.4±8.4％，纤维化包裹的微囊占3.6±1.3％；而BPA微囊的56天回收率为79.4±7.9％，纤维化包裹的微囊占3.5±1.7％。这些结果说明我们制备的BPA微囊比APA微囊的移植强度要好(p＜0.005)，生物相容性相似。3．采用激光扫描共聚焦显微镜和FITC标记的Dextran测得微囊膜的通透性，以了解两种微囊作为免疫隔离屏障并支持囊内细胞生存的基础。结果表明：两种微囊膜均具有一定的截割范围，4kD的小分子物质可自由扩散进入微囊内；70kDa的中等分子物质可部分通过；而150 kDa的大分子物质不能通过微囊膜。免疫球蛋白分子量最小的IgG近似于150 kDa，这说明我们制备的微囊膜可以作为免疫隔离屏障并支持囊内细胞生存。三、细胞的原代分离培养鉴定以及微囊化细胞的制备1．采用改良的Seglen两步门静脉胶原酶灌注法原代分离大鼠肝细胞，以血细胞计数板计算肝细胞的产率，并用0.4％的台盼蓝拒染实验检测肝细胞的成活率。若肝细胞的成活率在90％以下，则加用Percoll细胞分离液进一步纯化。2．制备微囊化肝细胞，取其培养液与游离肝细胞的培养液，检测白蛋白含量，结果表明现在体外的培养液中检测到白蛋白的分泌两者差异不大，而且培养过程中，2周内微囊及囊内肝细胞保持完整形态，几无破损，光镜下动态观察微囊形态完整，表面光滑，因此可知BPA微囊不影响肝细胞功能的发挥。四、微囊化肝细胞移植治疗肝衰动物模型由于肝衰会导致肝细胞的大面积死亡，而肝细胞坏死时，肝细胞内的各种酶释放到血液中，导致酶指标增高。因此我们将制备的微囊化肝细胞或者共包裹的肝细胞和睾丸支持细胞移植入肝衰大鼠模型的腹腔，于移植后的1d、3d、7d、2w、3w、4w、5w、6w眼眦静脉取血，测血液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)，白蛋白(ALB)的值，结果表明：共包裹组的数值明显高于单独包裹肝细胞的组，而微囊化肝细胞组又高于游离的肝细胞组，证明睾丸支持细胞的免疫豁免作用保护了肝细胞的功能发挥，而且我们制备的BPA微囊也具有免疫屏障作用，能够提高微囊内肝细胞的功能。本研究结果表明：我们研制的BPA微囊除具有与APA微囊相似的生物相容性和通透性等外，还具有机械强度高的优点。采用BPA微囊包裹肝细胞或与肝细胞共包裹睾丸支持细胞后体内移植，对肝衰大鼠模型具有良好的治疗作用。