【摘 要】
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新洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia cenocepacia是一种人体条件致病菌,易感染囊性纤维化（CF）患者等免疫低下群体,引起感染患者肺功能严重下降,严重时可引起全身性感染,被称为“洋葱伯克氏菌综合症”。由于临床上B.cenocepacia对多种常用抗生素产生耐药性,由B.cenocepacia引起的感染常难以治疗,因此亟待开发新型的靶标治疗药物以应对日益严重的耐药性问题。群体感应（Qu
【基金项目】
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华南农业大学博士生创新人才培植计划（国内培养）的支持（项目编号CX2018N013）；
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新洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia cenocepacia是一种人体条件致病菌,易感染囊性纤维化（CF）患者等免疫低下群体,引起感染患者肺功能严重下降,严重时可引起全身性感染,被称为“洋葱伯克氏菌综合症”。由于临床上B.cenocepacia对多种常用抗生素产生耐药性,由B.cenocepacia引起的感染常难以治疗,因此亟待开发新型的靶标治疗药物以应对日益严重的耐药性问题。群体感应（Quorum sensing,QS）系统被广泛应用于病原菌调节生物学功能和致病毒力,是一类新型的药物靶点。据报道,Rpf FR系统和Cep IR系统是B.cenocepacia中2种主要的QS系统,参与鞭毛运动、生物膜形成、胞外酶产生以及致病毒力等多种生物学功能的调控。其中,Cep IR系统受Rpf FR系统正调控。因此,Rpf FR系统是B.cenocepacia中理想的药物靶点。在本研究中,以Rpf FR系统为研究对象,对其毒力调控网络进行系统研究、并筛选针对Rpf FR系统的QS抑制剂。现将结果报道如下:在本文第二章节中我们报道了一种新型双组分系统Rqp SR,它在调节B.cenocepacia的QS系统和致病机制中发挥着重要作用。为证明Rqp S和Rqp R互作关系,通过细菌双杂交实验和GST pull-down实验,证明了Rqp S和Rqp R之间存在直接的相互作用;在RNA-seq结果中,rqp S和rqp R突变体所调控的差异表达基因存在大量重叠;并且,rqp S和rqp R突变体也表现出相似的生物学表型缺陷,包括QS信号产量降低、群集运动活性丧失、生物膜产量显著降低、毒力显著减弱等,上述结果说明Rqp S和Rqp R组成双组分系统。在对双组分系统Rqp SR调控方式研究中,Rqp R通过与DNA启动子直接结合来控制目标基因的表达,这些目标基因包括BDSF信号合成酶基因rpf FBc、AHLs信号合成酶基因cep I和凝集素合成基因簇bcl ACB。这一结果表明Rqp SR系统通过影响其QS信号合成酶基因的转录表达以调节QS系统,此外,Rqp SR系统还能直接调控其它目标基因的转录表达。综上所知,Rqp SR系统通过与QS系统形成复杂的层次结构来调节B.cenocepacia生理和致病毒力。通过BLAST分析,双组分系统Rqp SR在多种细菌中高度同源,表明这种调控模式可能在细菌中普遍存在。在本文的第三章节中我们合成了22个BDSF信号类似衍生化合物,随后对这些候选化合物的QS抑制活性进行筛选,并对筛选到的QS抑制剂作用机理进行研究。结果,从22个候选化合物中筛选到一种广谱、高效的QS抑制剂-14-Me-C16:Δ2（顺式-14-甲基-2-十六烯酸）。对其抑制活性进行分析可知,当在B.cenocepacia H111中外源添加14-Me-C16:Δ2时,14-Me-C16:Δ2显著抑制QS信号产量（AHLs信号和BDSF信号）,并抑制受Rpf FR系统调控的生物学表型,包括群集运动性活性、生物膜产量和致病毒力都显著降低。此外,14-Me-C16:Δ2并不抑制供试Burkholderia spp.的生长。对其抑制机制的研究表明,14-Me-C16:Δ2抑制QS系统是通过抑制其QS信号合成酶基因转录表达实现的。并且,14-Me-C16:Δ2还能影响多种Burkholderia spp.中受Rpf FR系统调控的生物学表型。这些发现表明,14-Me-C16:Δ2作为一种针对Rpf FR系统的抑制剂,可为后续致病性洋葱伯克霍尔德菌治疗药物开发提供候选的先导化合物。在本文第四章节对新洋葱伯克霍尔德菌中Rpf B同源蛋白Nqs R功能进行了初步研究,结果表明nqs R突变体群集运动活性、生物膜产量、蛋白酶活性均显著增强。此外,在A549细胞侵染模型中,nqs R突变体毒力也明显提高。利用RNA-seq技术对nqs R突变体中差异表达基因进行分析。结果显示,与野生型菌株H111相比,nqs R突变体中有208个基因差异表达,其中下调表达基因157个,上调表达基因51个。这些基因与脂肪酸代谢、膜蛋白、氨基酸代谢及运输、能量代谢及运输、嗜铁素合成及运输、信号转导和转录调控等。Nqs R蛋白功能的初步研究为后续研究BDSF信号转换机制奠定了一定的基础。也进一步加深了我们对B.cenocepacia毒力调控网络的认识。
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