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本研究拟直接从基因水平出发,利用基因克隆、分析和表达等方法手段研究酶组分的相关性质,以有效解决在酶学研究中遇到的阻力,为进一步了解纤维堆囊菌纤维素酶组分的组织结构方式和纤维素降解机制奠定基础。
首先对实验室分离得到的部分纤维堆囊菌菌株进行了初步的纤维素酶酶活(CMC酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶等)测定分析,证明纤维素降解特性在实验室分离得到的纤维堆囊菌中普遍存在,但不同菌株表现出不同的纤维素降解能力,不同菌株中各种纤维素酶组分的活力比例也存在差异。
根据上述结果和实验室前期工作基础,选定纤维堆囊菌(S,cellulosum)菌株So9733-1作为纤维堆囊菌纤维素降解相关酶系研究的模式菌株,以酶活性普遍较高的木聚糖酶为分析靶标,进行So9733-1木聚糖酶基因的克隆、分析和表达研究。设计和收集了10条不同的引物对对So9733-1基因组DNA进行PCR扩增,经片段纯化、克隆和测序分析发现,GH10-F/GH10-R引物对扩增出的一个长度为422bp的片段,经BLAST比对分析显示该片段为木聚糖酶基因片断,属于糖苷水解酶F/10家族。利用GH10-F/GH10-R引物对还在其他纤维堆囊菌菌株中获得了不同长度和氨基酸组成的木聚糖酶基因片断,表明木聚糖酶基因在堆囊菌中的普遍存在性和多样性。这一结果与酶活测定中显示的结果较吻合。利用获得的木聚糖酶氨基酸片断与其他微生物来源的木聚糖酶片断重建系统演化关系,结果表明来源于纤维堆囊菌的木聚糖酶片断在Neighbor-joining系统进化树上处于相对独立的分支,可能属于新型的木聚糖酶。
以试验筛选的合适的限制性内切酶SalⅠ消化纤维堆囊菌So9733-1基因组DNA,以So9733-1中获得的422bp木聚糖酶基因片段为探针,结合Southern杂交,建立了含有阳性杂交片段的亚克隆文库,经对文库克隆子的质粒提取和斑点杂交逐级筛选,得到了4个阳性克隆子,经测序分析获得了两个完整的木聚糖酶基因,定名为xynA、xynB。生物信息学分析表明,xynA、xynB的开放阅读框(ORF)大小分别为1302bp、1197bp,编码433aa、398aa的多肽链。同GenBank数据库比对分析得知氨基酸序列相似性分别为60%、70%。
采用亚克隆技术,设计带有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的PCR引物分别扩增出xynA和xynB两个木聚糖酶基因的ORF区,以pET-22b(+)作为表达载体,NdeⅠ、XhoⅠ双酶切后连接转化受体菌E.coliBL21(DE3)中表达木聚糖酶基因,分别获得了阳性重组表达子BL-pET-xynA、BL-pET-xynB,分析表明BL-pET-xynA、BL-pET-xynB诱导表达产物均为包涵体形式,经尿素梯度透析方法复性后,均具有木聚糖酶活性,其中BL-pET-xynA酶活性较低,不适合进行后续酶学性质分析,有待于进行进一步的研究。而对复性纯化后的BL-pET-xynB表达产物进行初步的酶学性质分析表明,该木聚糖酶的Km值为1.2mg/ml,最适反应温度为45℃左右,最适pH为6.5左右。酶对温度稳定性较差,55℃以上保温30min酶活几乎完全损失;pH4.0-8.0之间较为稳定。不同浓度的金属离子会对酶活性产生不同的影响,离子浓度的增加会产生负面效应,5mmol/l的Zn2+、Cu2+对酶活有强烈的抑制作用,1mmol/l的Na+、K+对酶活有明显的激活作用。以木聚糖为底物,薄板层析(TLC)方法对酶解产物分析表明,产物主要为低聚木寡糖(木二糖、木三糖、木四糖等),该酶属于内切型木聚糖酶。