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目的:通过巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)及其受体(CSF-1R)在糖尿病大鼠视网膜表达及对体外培养小胶质细胞的作用研究,探讨糖尿病视网膜病变中微环境的变化对视网膜小胶质细胞激活的影响及小胶质细胞的激活机制及作用。
方法:体内部分 采用一次性腹腔注射链脲佐菌霉素(streptozotocin,STZ)方法建立成年SD(Sprague-Dawley)大鼠糖尿病动物模型。在建模后2,4,8,12周,随机取8只糖尿病大鼠视网膜,冰冻切片行免疫组织化学,激光共聚焦显微镜下观察M-CSF及其受体CSF-1R在视网膜的表达情况,免疫荧光双标染色观察视网膜小胶质细胞(CD11b/C)、星形胶质细胞(GFAP)、Müller细胞(Vimentin)、神经节细胞(NeuN)中的共表达情况。Real-time PCR、Western blot法测量各组大鼠视网膜M-CSF和CSF-1R的mRNA及蛋白质表达量的变化。均采用同龄大鼠5只作为对照。此外,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定22例增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)患者玻璃体样本中M-CSF的蛋白含量,22例特发性黄斑裂孔的玻璃体样本作为对照。
体外部分 原代视网膜小胶质细胞培养鉴定。采用糖基化人体白蛋白(GA)刺激小胶质细胞,光镜、免疫荧光染色观察作用前后小胶质细胞的形态及激活标志Ibal、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1 β的表达变化。ELISA法测量激活的小胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β和M-CSF的蛋白含量变化情况。免疫荧光染色法、Real-time PCR、Western blot及免疫沉淀法测量GA激活的视网膜小胶质细胞CSF-1R的表达变化。ELISA法分别测量M-CSF组、M-CSF抗体组、CSF-1 R抗体组、GA+M-CSF组、GA+M-CSF抗体组、GA+CSF-1 R抗体组TNF-α和IL-1β蛋白含量的变化,单独GA组的小胶质细胞作为对照。
结果:体内部分 正常大鼠视网膜上可持续低水平表达M-CSF及受体CSF-1R。在糖尿病大鼠2周,视网膜上M-CSF及其受体CSF-1R mRNA、蛋白的表达水平均较同龄对照组明显上调(p＜0.005),并随时间推移继续增加。免疫荧光双标染色显示M-CSF的免疫活性上调主要发生在糖尿病大鼠视网膜的神经纤维层,与GFAP共表达。上调的CSF-1R免疫活性主要在0X-42标记的小胶质细胞。NeuN标记的神经节细胞持续表达CSF-1R。ELISA结果显示PDR病人玻璃体中M-CSF的蛋白含量明显高于对照组(p＜0.005)
体外部分体外培养的视网膜小胶质经GA刺激后从杆状静息状态转变为胞体更大、类圆型的阿米巴样激活状态。激活后的小胶质Ibal表达明显增强,并从胞桨转移到胞膜皱褶上。GA刺激后小胶质细胞释放TNF-α和IL-1β(P＜0.05),呈剂量依赖方式,GA浓度为250μg/ml时达到释放峰值。免疫荧光、Real-time PCR及免疫沉淀显示GA激活的小胶质细胞表达CSF-1R明显上调(P＜0.05),而未经GA刺激的小胶质细胞仅表达基线水平的CSF-1R。抗体中和试验显示M-CSF抗体或CSF-1R抗体中和可明显降低GA激活的小胶质细胞释放TNF-α仅和IL-1 β(P＜0.001)。M-CSF本身不能诱导小胶质细胞TNF-α和IL-1β的释放,但M-CSF+GA组TNF-α和IL-1 β的含量明显高于单纯GA刺激组(p＜0.05)。
结论:1.糖尿病早期视网膜上M-CSF/CSF-1R信号明显上调,星型胶质细胞是M-CSF上调的主要来源,小胶质细胞激活并特性高表达CSF-1R,该信号可能是糖尿病视网膜病变中神经元、胶质细胞及小胶质细胞之间重要的信号调控通路 2.糖基化白蛋白体外能直接诱导视网膜小胶质细胞激活,释放TNF-α、IL-1 β等致炎介质3.激活的视网膜小胶质细胞高表达CSF-1R,通过自分泌或旁分泌M-CSF,扩大了GA诱导的小胶质细胞炎症