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微生物降解植物甾醇侧链生成甾体药物中间体的研究，在甾体药物生产中具有重要价值，引起了许多研究者的关注。目前在微生物转化植物甾醇方面，仍然有许多问题需要解决。其中的一个主要问题是甾醇的低溶解性限制了传质效率，造成甾醇转化速率和转化率低下;另外一个问题是微生物降解甾醇侧链代谢复杂，有许多不必要的中间代谢产物积累，造成了原料浪费，且使得后续产物纯化难度加大。本课题以实验室获得的分枝杆菌为研究目标，针对甾醇转化中存在的两个问题，进行了大量实验探究，设定不同转化体系，对不同体系下的代谢情况进行了分析，并试图对其代谢过程进行调控，从而解决副产物积累的问题。 首先，选取吐温80和羟丙基-β-环糊精作为助溶剂，增加了甾醇溶解度，使得反应速率和甾醇转化率都明显提升。当使用分枝杆菌NwIB-01MS（主要产物为ADD）时，添加0.05％的吐温80，ADD的最高积累由无助溶剂时的400mg/L提高到了550mg/L，甾醇转化率则由36.7％上升到了70.2％。而加入与植物甾醇摩尔比1∶1的HP-β-CD时，ADD浓度和甾醇转化率分别为1250mg/L和72.5％。但是，两者对于甾醇转化代谢途径都有一定的影响。首先，吐温80的加入，会对C17-羟基化反应起到促进作用，从而促进了睾酮和宝丹酮两种C17-羟基化产物增加，而抑制C1，2-脱氢反应，使得C1，2-脱氢产物总比例降低，最终导致ADD的浓度在第四天时降到了150mg/L。HP-β-CD则与吐温80起到了相反的作用，抑制了C17-酮基被还原为羟基，而促进了C1，2-脱氢反应的进行，使得ADD积累量更高后期没有浓度降低的现象。另外，环糊精的使用，使得侧链不完全降解产物1，4-HBC和HBC的比例升高，占总产物的比例分别增加到10.3％和2.2％。同时还试验了静息细胞-环糊精体系，具有更高的甾醇转化效率，使用菌株NwIB-R10转化AD时，底物浓度可以达到50g/L，AD积累量11.4g/L。但是HBC积累也更加明显，与AD质量比例达到1∶1.1。 随后，针对菌株NwIB-R10在转化甾醇生成AD的过程中，大量积累侧链不完全降解产物HBC这一现象，利用不同转化条件得到了不同反应速率，从中总结出HBC积累的规律，即HBC的生成是与单位细胞生产速率成正相关的。生长细胞体系中，不加环糊精时，单位细胞反应速率不到0.5mmol/L/d，基本没有HBC积累;但加入环糊精后，特别是静息细胞体系中，如10mL体积，50g/L底物浓度时，随着菌体浓度升高，单位细胞反应速率由44mmol/L/d降至23.4mmol/L/d，此时AD与HBC比值由最初的0.78∶1升高到1.5∶1。特别是200g/L菌浓，50g/L底物，20mL体积时，单位细胞速率降低到9.4mmol/L/d，AD/HBC可以达到3.3∶1。分析其原因，一方面可能是由于甾醇侧链降解过程中，产生的大量NAD(P)H无法及时消耗，造成胞内还原力水平升高，使得某些中间代谢物被还原，无法继续进行降解反应。另外一个原因可能是在甾醇复杂的侧链降解代谢过程中，某一步生化反应速率不足，导致了中间产物的积累，从而最终导致还原产物HBC的积累。 最后，针对上面提出的假设，试图对侧链降解代谢过程进行调控，达到减少HBC积累的目的。首先采取了构建一个辅酶再生系统的方案。4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)可以在某些氧化还原酶作用下，以NAD(P)H为辅酶，生成4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)，从而消耗掉胞内过高的还原力。在转化体系内添加0.75g/L的COBE，可以明显降低HBC的生成，由10.4g/L降低到5.8g/L。而COBE浓度提高到1.5g/L时，HBC的生成量更低，只有3.4g/L。COBE的加入会微弱稍微降低甾醇的初始转化速率，但对AD的最终积累浓度基本没有影响，均在11g/L，表明采取的方法取到了一定效果。然后又利用基因工程方法，加强了侧链降解过程中可能的限制因素羟酰辅酶A脱氢酶—Hsd4A的表达。在生长细胞体系中，基本没有了HBC的积累，而静息细胞体系中最高也只有0.66g/L，但甾醇转化率并没有变化，如在100g/L菌浓和50g/L底物时，同原始菌相比均为63％。减少的HBC部分转化为AD，使得AD的生成浓度最高可达16.5g/L，同时造成ADD的量略有升高。说明Hsd4A是侧链降解中的一个限制因素，通过它的强化表达，可以很好的解决HBC的积累问题，同时还会造成代谢分布的改变。 通过上面的实验，也证明了我们的推测:单位细胞生产速率加快，导致HBC的大量积累，一方面是由于在侧链降解过程中，存在着限制因素，即Hsd4A活性不足，导致侧链降解不够顺畅;另一方面，是由于NAD(P)H等还原力的过量积累，使得中间代谢产物被还原，而无法继续参与反应，从而以HBC的形式积累下来。