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鸡白痢沙门菌是宿主(禽)适应性病原菌,既能水平传播又能垂直传播,易导致雏鸡的高致病性和高死亡率,易对禽养殖业造成严重的经济损失,因此鸡白痢在我国种禽场是优先防控和重点防治的主要疾病之一。但是,当前鸡白痢沙门菌检疫淘汰的防控措施在我国未能达到预期效果,希冀研发新型疫苗和药物等措施,以尽早实现我国种禽场鸡白痢沙门菌净化。脂多糖是沙门菌的重要致病因子,其合成基因是研发新型疫苗和药物的靶基因。脂多糖由类脂A、核心多糖和O抗原构成,其中O抗原的结构变异是光滑型和粗糙型转换的基础,但在鸡白痢沙门菌致病机制中研究较少。因此,为寻找脂多糖生物合成基因,本研究应用信号标签突变技术建立鸡白痢沙门菌转座突变库,通过玻板凝集试验筛选与O9单抗不发生玻板凝集的粗糙型突变株,并对其免疫生物学特性进行初步分析,进一步了解脂多糖合成基因对鸡白痢沙门菌致病性的效应。1.粗糙型鸡白痢沙门菌的筛选及其功能基因鉴定应用转座突变技术构建鸡白痢沙门菌S06004转座突变库,利用O9单克隆抗体与粗糙型沙门菌不发生玻板凝集的现象进行高通量筛选,并通过吖啶橙方法予以验证。从10,022株突变株中筛选得到4株粗糙型突变株,PCR扩增转座子侧翼序列并测序,基因比对结果显示,rfbE、rjbM和rfc基因被鉴定,rfbE和rfbM分别负责编码CDP-泰威糖-2-差向异构酶和甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶,rfc编码O抗原聚合酶。结果表明rfbE、rfbM和rfc基因参与鸡白痢沙门菌脂多糖的生物合成,为进一步鸡白痢沙门菌致病性研究提供靶基因。2.rfbE、rfbM和rfc单基因突变株免疫生物学特性的初步分析S06004△rfbE、S06004△rfbM和S06004Arfc缺失突变株被构建,并对其生物学特性进行初步研究。LPS银染试验、自凝集试验和免疫印迹试验结果表明,转座突变株、S06004ArfbE、S06004ArfbM和S06004△rfc都呈现出典型的粗糙型特性。细胞试验表明,rfbE、rfbM和rfc突变株对HD-11细胞黏附、侵袭能力和胞内增殖率都低于野生株。在毒力方面,S06004△rfbE、S06004△rfbM和S06004△rfc的毒力分别下降100.0倍,120.0倍和18.0倍,表明rfbE和rfbM基因与鸡白痢沙门菌的毒力密切相关,而rfc基因对毒力的影响较小。体内动态消长试验结果表明,缺失株和转座子插入突变株感染的鸡肝脏和脾脏中分离到的鸡白痢沙门菌数量低于野生株,表明其比S06004更易被机体清除。免疫保护试验研究发现,突变株血清中的IgG抗体效价高于空白组,能够引起很好的体液免疫,免疫保护野生菌致死剂量。荧光定量PCR检测发现,IL-2、IFN-γ和IL-1β在免疫初期大量表达,而IL-4在免疫后表达量明显上调,表明S06004△rfbE、S06004△rffbM和S06004△rfc能诱导良好的细胞免疫和体液免疫。S06004△rfbE、S06004△rfbM和S06004△rfc均能提供良好的免疫保护。3.rfbE和spiC双基因突变株免疫生物学特性的初步分析本研究应用同样方法构建了 S06004△rfbE△spiC。S06004△rfbE△spiC脂多糖部分组分缺失,具有粗糙型特征,而对生化特性无影响。与野生株相比,毒力下降约405.1倍,并且在肝脏和脾脏中都未能分离到缺失株。S06004ArfbE△spiC感染前期血清效价较低,3周后明显高于空白组,表明S06004△rfbEAspiC能提供良好的免疫保护效力。综上所述,rfbE、rfbM和rfc基因参与LPS的合成,并与鸡白痢沙门菌的致病性相关。这些结果不仅拓宽我们对LPS合成和鸡白痢沙门菌致病性的了解,也为疫苗研发提供潜在的基因靶点。