【摘 要】
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研究背景弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是成年人中最常见的淋巴恶性肿瘤。目前采用的R-CHOP一线化疗方案可以治愈约60%的患者,然而对于难治性/复发性DLBCL及年龄>60岁的老年患者疗效差。myc基因异常表达约占DLBCL的20%,是DLBCL难治、复发的主要原因,所以myc信号途径是治疗DLBCL的重要靶点。miR34a和let7在
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研究背景弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是成年人中最常见的淋巴恶性肿瘤。目前采用的R-CHOP一线化疗方案可以治愈约60%的患者,然而对于难治性/复发性DLBCL及年龄>60岁的老年患者疗效差。myc基因异常表达约占DLBCL的20%,是DLBCL难治、复发的主要原因,所以myc信号途径是治疗DLBCL的重要靶点。miR34a和let7在DLBCL中低表达,可调控myc基因,且myc和miR34a交互作用易形成恶性循环,加重DLBCL的不良预后,提高这两种microRNA在DLBCL细胞的表达,可能成为治疗myc基因异常表达DLCBL的新手段。溶瘤病毒治疗作为一种新起的生物免疫治疗方式,可以通过直接的溶瘤作用、诱发机体抗肿瘤免疫或搭载抑癌基因发挥巨大的抗肿瘤作用。研究目的我们设想通过构建一种搭载miR34a和let7双基因的溶瘤病毒用于治疗DLBCL,在溶瘤病毒发挥杀伤作用的同时有效上调肿瘤细胞中miR34a和let7抑癌基因表达,实现对弥漫大B细胞淋巴瘤的有效治疗。研究方法1.应用基因重组技术使得痘苗病毒载体缺失TK序列,并插入外源基因mir34a-IRES-let7或单基因mir34a、let7,通过PCR、核酸凝胶电泳、测序和qRT-PCR实验对重组溶瘤病毒进行鉴定。2.体外实验验证新型重组溶瘤痘苗病毒对淋巴瘤细胞的杀伤作用:2.1应用TCID50法检测系列溶瘤病毒在淋巴瘤细胞中复制效率,用CCK-8法观察和比较它们对DLBCL细胞的生长抑制和杀伤作用;2.2用流式细胞仪评价系列溶瘤病毒对淋巴瘤细胞凋亡的影响;2.3 qRT-PCR实验检测病毒处理组细胞miR34a和let7的表达;3.基于miR34a和let7信号通路抗DLBCL分子机制研究:通过qRT-PCR检测研究重组溶瘤病毒处理后miR34a、let7下游信号FOXP1/Notch-1/Bcl-2/SIRT1以及c-myc/K-ras/HMGA2/lin28等癌基因和抑癌基因的表达调控情况;4.探究重组溶瘤痘苗病毒OVV-mir34a-IRES-let7在小鼠荷瘤模型中抗淋巴瘤作用:利用NCG小鼠构建了OCI-LY3皮下移植瘤模型,注射系列重组溶瘤痘苗病毒后观察肿瘤大小、小鼠生存期情况,比较不同病毒的体内抗肿瘤能力;采用qRT-PCR实验检测病毒处理组小鼠外周血、脾脏、肝脏、肺、肾脏的病毒基因水平。研究结果1.本课题运用细胞内同源重组技术,成功构建表达miR34a和let7的新型溶瘤痘苗病毒。2.体外实验:2.1 TCID50病毒滴度检测结果显示系列重组溶瘤痘苗病毒在淋巴瘤细胞内复制效率无明显差异。2.2 CCK-8结果显示双基因溶瘤病毒OVV-mir34a-IRES-let7对淋巴瘤细胞具有较强的杀伤效应,单基因病毒的杀伤能力次之但是强于空载溶瘤病毒组,所有病毒处理组的杀伤效果均高于PBS对照组。2.3流式细胞仪凋亡检测结果显示OVV-mir34a-IRES-let7对淋巴瘤细胞具有促凋亡作用。3.qRT-PCR结果显示OVV-mir34a-IRES-let7处理有效降低了miR34a及Let7下游靶基因表达水平。4.体内动物实验结果显示,OVV-mir34a-IRES-let7发挥了极强的体内抗淋巴瘤效应,延长小鼠生存期。qRT-PCR结果证实双基因溶瘤病毒处理组肿瘤组织中目的基因miR34a和Let7的上调。此外,外周血,正常组织中未检测到病毒基因的表达。研究结论本课题首次成功构建了一种携带双基因的新型重组溶瘤痘苗病毒OVV-mir34a-IRES-let7,体内外实验证实了其抗淋巴瘤活性。我们的发现为OVVs和miRNAs（miRNA-34a和let7）联合治疗DLBCL患者,尤其是myc和Bcl-2高表达的DLBCL患者提供了临床前基础。
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