论文部分内容阅读
肠道病原细菌成功感染宿主需要耐受胃部的强酸性环境，对其耐酸机理的研究可以为控制感染和传播提供理论基础。假结核耶尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis,Yp)是耶尔森氏菌属三种人类致病菌之一，主要通过污染的水和食物在人和动物间传播。本研究基于蛋白组学和基因组学等方法，从整体水平对Yp耐酸机理进行了探讨。论文包括以下三个方面的内容：
⑴采用比较蛋白组学方法，比较了Yp野生型和ompR缺失突变株在中性和酸性条件下总蛋白表达差异，确定了脲酶组分是双组分调控蛋白OmpR调控耐酸过程中的重要靶标之一。脲酶通过降解尿素产生氨中和酸性环境，促进Yp在酸性环境下存活。通过比较Yp和ompR突变株脲酶表达及酶活差异，确定了OmpR对脲酶的正调控作用，并通过体外蛋白-DNA相互作用，证明了OmpR对脲酶组分表达是发挥直接的调控作用。
⑵通过比较Yp在pH7.0和pH4.5条件下总蛋白表达差异，发现天冬氨酸解氨酶(AspA)在酸性条件下表达明显上调。AspA降解天冬氨酸(Asp)产生延胡索酸和氨，氨可以中和耐酸过程中菌体胞内pH偏酸的环境。基于此假设，构建了aspA基因缺失突变株，检测了野生型和aspA突变株在含有天冬氨酸的酸性溶液中耐酸能力的差异，最终发现了病原细菌一条新的依赖于Asp的耐酸途径。通过蛋白组分析，发现参与糖代谢的fruBKA基因在酸性条件下表达明显上调，该基因的表达又受到糖代谢主调控蛋白Cra的负调控作用。通过比较野生型和cra缺失突变株耐酸能力的差异，证明了Cra在Yp耐酸过程中的负调控作用。
⑶通过构建Yp的Tn插入突变库，从基因组水平直接比较野生型和突变库中各菌株体外耐酸能力的差异。从8848株突变体中筛选到32株能够增强或降低Yp耐酸的突变株，对突变位点进行鉴定，发现这些突变与能量代谢、压力耐受、细菌毒力系统、细胞壁结构、非编码区等生理功能相关。通过构建缺失突变株进行进一步基因功能分析，确定了参与谷胱甘肽合成、T3SS毒力系统、细胞壁合成等基因在Yp耐酸过程中的功能。