纳豆激酶基因在大肠杆菌和乳酸菌中的表达及乳酸菌食品级表达载体的构建

来源 :中国科学院微生物研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zht336
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从我国传统发酵食品豆豉中分离到53株纤溶酶产生菌,对其中纤溶活性最高的38号菌株进行形态学、生理生化特性和16S rDNA鉴定,结果表明该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis YF38。采用PCR方法克隆了38号菌的纤溶酶编码基因,该基因全长1474 bp,包含一个1143 bp的开放阅读框(ORF),编码381个氨基酸,与纳豆激酶(NK)基因的DNA序列同源性达99%,而且与纳豆激酶仅有一个氨基酸不同,因而是一种来源于豆豉的纳豆激酶。   使用NK自身信号肽(SPnk)和来源于欧文氏杆菌的信号肽(PelB)分别构建大肠杆菌分泌表达载体pXB503和pXB504,使NK基因在大肠杆菌中获得了分泌表达。在20℃、0.7 mM IPTG诱导20小时条件下,E.coli BL21(DE3)plys/pXB504培养液中纤溶活性可达260 U ml-1。另外,使用乳链菌肽(nisin)诱导表达系统(NICE)和乳酸菌信号肽Usp45也实现了NK基因在乳酸乳球菌中的分泌表达。纤溶活性检测和Western blotting结果表明在30℃、诱导剂(nisin)浓度为50 ng ml-1、诱导时间8小时,Lactococcus lactis NZ9000/pXB622培养液中的纤溶活性为41.7 U m1-1,94%的表达产物分泌到了胞外。   为了构建乳酸菌食品级表达载体,首先克隆了来源于乳酸菌的nisin抗性基因(nsr)。Western blotting结果显示该基因在Lactococcus lactis MG1363中获得了高效表达,重组乳酸菌的nisin抗性水平高达600 IU ml-1以上。以nisin抗性作为选择性标记,gfp为报告基因,构建了乳酸菌组成型表达载体pXB813和nisin诱导型表达载体pXB823,含有这两种载体的乳酸乳球菌均能表达GFP。载体的稳定性分析表明所构建的载体较稳定。   实验中发现在以nisin抗性作为选择性标记时,GFP的诱导表达需要诱导剂(nisin)的浓度高达10μg ml-1以上,而在以红霉素抗性为唯一选择标记时,其诱导剂浓度仅需50 ng ml-1。虽然将纳豆激酶基因克隆在以红霉素抗性和nisin抗性为选择标记的双抗载体上,转化乳酸乳球菌所获得的重组菌可以诱导表达纳豆激酶,但其食品级表达未能获得成功。
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