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从我国传统发酵食品豆豉中分离到53株纤溶酶产生菌,对其中纤溶活性最高的38号菌株进行形态学、生理生化特性和16S rDNA鉴定,结果表明该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis YF38。采用PCR方法克隆了38号菌的纤溶酶编码基因,该基因全长1474 bp,包含一个1143 bp的开放阅读框(ORF),编码381个氨基酸,与纳豆激酶(NK)基因的DNA序列同源性达99%,而且与纳豆激酶仅有一个氨基酸不同,因而是一种来源于豆豉的纳豆激酶。
使用NK自身信号肽(SPnk)和来源于欧文氏杆菌的信号肽(PelB)分别构建大肠杆菌分泌表达载体pXB503和pXB504,使NK基因在大肠杆菌中获得了分泌表达。在20℃、0.7 mM IPTG诱导20小时条件下,E.coli BL21(DE3)plys/pXB504培养液中纤溶活性可达260 U ml-1。另外,使用乳链菌肽(nisin)诱导表达系统(NICE)和乳酸菌信号肽Usp45也实现了NK基因在乳酸乳球菌中的分泌表达。纤溶活性检测和Western blotting结果表明在30℃、诱导剂(nisin)浓度为50 ng ml-1、诱导时间8小时,Lactococcus lactis NZ9000/pXB622培养液中的纤溶活性为41.7 U m1-1,94%的表达产物分泌到了胞外。
为了构建乳酸菌食品级表达载体,首先克隆了来源于乳酸菌的nisin抗性基因(nsr)。Western blotting结果显示该基因在Lactococcus lactis MG1363中获得了高效表达,重组乳酸菌的nisin抗性水平高达600 IU ml-1以上。以nisin抗性作为选择性标记,gfp为报告基因,构建了乳酸菌组成型表达载体pXB813和nisin诱导型表达载体pXB823,含有这两种载体的乳酸乳球菌均能表达GFP。载体的稳定性分析表明所构建的载体较稳定。
实验中发现在以nisin抗性作为选择性标记时,GFP的诱导表达需要诱导剂(nisin)的浓度高达10μg ml-1以上,而在以红霉素抗性为唯一选择标记时,其诱导剂浓度仅需50 ng ml-1。虽然将纳豆激酶基因克隆在以红霉素抗性和nisin抗性为选择标记的双抗载体上,转化乳酸乳球菌所获得的重组菌可以诱导表达纳豆激酶,但其食品级表达未能获得成功。