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本论文以仔猪肠上皮细胞(IPEC-J2)为试验模型,考察在正常培养和应激状态下,氧化锌(ZnO)与细胞炎症反应的关系,通过探寻氧化锌影响炎性因子基因表达的信号通路,揭示氧化锌调控肠上皮细胞炎症反应的机理。本研究包括以下四个试验:
试验一氧化锌对正常培养猪肠上皮细胞炎症反应的影响试验以正常培养仔猪肠上皮细胞(IPEC-J2)为模型,设计不同ZnO水平(即对照、低、中和高水平,分别为0、0.05、0.1、0.15mmol/L),不同培养时间(0.5 h(短时间),1.5 h、4.5 h(较长时间)和24h(长时间)),通过测定培养基锌含量和抗氧化酶活性,细胞炎性因子基因表达和分泌和调控炎症反应蛋白的基因表达,研究了ZnO与肠上皮细胞炎症反应的关系。结果表明:
1.高浓度ZnO提高锌进入细胞的流量。中高浓度ZnO短时间显著提高SOD活性(P＜0.01)和CuZn-SOD活性(P＜0.01),0.5h分别提高SOD15.92％和31.65％,提高CuZn-SOD62.85％和95.31％;高浓度ZnO在较长时间显著提高CuZn-SOD活性(P＜0.01),提高了细胞抗氧化能力,长时间无明显效果。
2.中高浓度ZnO,短时间显著降低TNF-α基因表达(P＜0.05),较长时间显著提高IL-10基因表达(P＜0.05);高浓度ZnO短时间刺激TNF-α显著上升(P＜0.05),低中浓度无明显影响,高浓度ZnO存在明显抗原刺激作用。ZnO降低细胞IL-1α分泌(P＜0.05),对IL-8无影响。
3.ZnO短时间显著降低TLR4基因表达(P＜0.05),高浓度ZnO长时间显著提高HSP70和caspase3基因表达(P＜0.05),高浓度ZnO长时间明显呈现强应激源作用,且促使细胞凋亡。
试验二肠上皮细胞炎症模型的建立本试验采用单因子设计,设6个脂多糖(LPS)处理浓度(0(对照组)、0.05、0.5、5、50和500mg/L),每个处理6个重复孔,通过测定TNF-α的分泌和细胞增殖,探讨LPS对肠上皮细胞炎症反应的影响,筛选适宜LPS水平,建立细胞炎症模型,为后续试验奠定基础。结果表明:与对照组相比,0.05、0.5mg/L LPS对细胞TNF-α分泌和细胞增殖无显著影响(P＞0.05),5 mg/L极显著提高了TNF-α分泌量,抑制细胞增殖(P＜0.01):随浓度增加,TNF-α分泌增加,细胞增殖抑制作用加强。LPS浓度为5mg/L是炎性细胞模型的建立的适宜浓度。
试验三氧化锌对LPS刺激猪肠上皮细胞炎症反应的影响本试验以LPS5mg/L刺激仔猪肠上皮细胞(IPEC-J2)为炎症模型,设计不同ZnO水平(即对照、低、中和高水平,分别为0、0.05、0.1、0.15mmol/L),不同培养时间(0.5 h(短时间),1.5 h、4.5 h(较长时间)和24h(长时间)),通过测定培养基锌含量和抗氧化酶活性,细胞炎性因子基因表达和分泌,以及调控炎症反应蛋白的基因表达,研究了ZnO在仔猪肠上皮细胞应激状态下与炎症反应的关系。结果表明:
1.LPS致仔猪肠上皮细胞应激状态下,高浓度ZnO提高锌进入细胞的流量;不同ZnO水平短时间和较长时间均显著提高TSOD活性(P＜0.05),中高浓度ZnO显著提高CuZn-SOD活性(P＜0.05)。
2.处于应激状态的仔猪肠上皮细胞,低浓度ZnO较长时间和中高浓度ZnO短时间均显著降低TNF-α基因表达和分泌(P＜0.05),显著提高IL-10基因表达和分泌(P＜0.05),且作用于IL-10的效果明显优于TNF-α。中高浓度ZnO短时间明显提高细胞抗炎能力,降低炎症反应。
3.仔猪肠上皮细胞遭遇应激,高浓度ZnO短时间,显著降低HSP70基因表达(P＜0.05),时间延长则显著上调HSP70基因表达(P＜0.05)。中高浓度ZnO短时间显著降低TLR4基因表达(P＜0.05),长时间显著提高KLF4基因表达(P＜0.05)。高浓度ZnO明显表现为强应激源作用,ZnO短时间则可对抗LPS引起的应激反应,降低炎症反应。
试验四氧化锌影响LPS处理肠上皮细胞炎性因子基因表达的信号通路研究本试验以LPS刺激IPEC-J2细胞为研究模型,考察信号通路阻断剂对ZnO诱导TNF-α和IL-10 mRNA表达的影响,以揭示应激状态下ZnO诱导炎性因子基因表达的信号转导机制。试验选用MEK1/2-ERK信号阻断剂PD98059,p38MAPK信号阻断剂SB202190,设8个处理组:ZnO+LPS组(对照组)、阴性组(LPS和ZnO均不加)、LPS刺激组(只加LPS,不加ZnO)、LPS+SB202190组、LPS+PD98059组、ZnO+LPS+SB202190组、ZnO+LPS+PD98059组、ZnO+LPS+SB202190+PD98059组试验结果表明,在LPS刺激IPEC-J2肠上皮细胞培养基中添加50μmol/L的PD98059极显著地降低由0.15 mmol/L ZnO诱导的TNF-α和IL-10mRNA表达(P＜0.01);添加1μmol/L SB202190对TNF-α和IL-10mRNA表达影响不显著。高浓度ZnO调控LPS刺激IPEC-J2肠上皮细胞TNF-α和IL-10mRNA表达,ERK是其信号转导通路之一,p38MAPK影响较小,也可能存在其他信号转导通路。
上述结果揭示,ZnO对仔猪小肠上皮细胞炎性细胞因子的影响明显存在选择性调节作用。仔猪小肠上皮细胞长时间接触高浓度ZnO,明显呈现抗原性致敏作用,短时间使用可通过下调TLR4基因表达,影响ERK信号转导通路提高抗炎性因子的基因表达和分泌,降低促炎性因子基因表达和分泌,提高细胞抗炎能力。高浓度ZnO对免疫系统的影响会明显提高抗炎因子的抗应激作用,抗炎因子可能是仔猪抗腹泻的重要细胞因子。