荔枝酸腐菌遗传转化体系的构建

• 作 者: 谢玲平
• 机 构: 福建农林大学
• 出 处: 福建农林大学
• 发表日期: 2010年01期
• 关键词: 荔枝酸腐菌 原生质体 遗传转化 GFP基因

荔枝酸腐菌是荔枝贮藏期的主要病原菌之一,在我国广东、福建等地均有发生。对于该病原菌的研究目前主要集中在其生长、产孢等影响因子的探讨,对其侵染致病以及与寄主植物之间的互作等分子生物学方面尚未见详细的研究报道。而了解病原菌与寄主的分子作用机理是发展新的防治策略的基础。绿色荧光蛋白基因是目前研究真菌的生态以及病原菌与寄主植物之间互作关系的主要标记基因,为了进一步探讨荔枝酸腐菌与寄主植物之间的互作机理,本研究就该病菌的遗传转化体系进行构建,并获得了一些初步的研究结果。实验结果进一步证明福建荔枝酸腐病的病原菌为Geotrichum candidum,该菌在培养基上的菌落为白色,表面粉状,菌丝无色,有隔膜,2-3次分叉,有内生孢子形成。分生孢子梗短,不分支,分生孢子串生；该菌的生长温度范围18-32℃,大于37℃培养条件下不生长。另外,本实验还系统的探讨了培养基种类、温度、pH值、光照时间以及转速等对该病菌菌丝形成的影响,结果表明,该病菌菌丝生长的最佳条件为pH为6.0的YEPD培养基,温度为30℃,光照为4-12h,转速为180rpm。荔枝酸腐菌原生质体释放和再生的最佳条件：培养基为YEPD培养基,酶组成为5mg·ml-1崩溃酶,酶解时间为4h,酶解温度为30℃,菌龄为2d,再生培养基为以20%蔗糖为渗透压稳定剂的YEPD培养基。最高可得到原生质体产量为58.66×106个.ml-1,再生率为0.155%。本研究构建了两个重组表达质粒pHAMT35G-gfp-Hmb和pHsp-gfp-Hmb,通过PEG介导转化系统成功的将绿色荧光蛋白基因转入荔枝酸腐菌中,转化子在荧光显微镜下可发荧光,通过PCR扩增结果表明绿色荧光蛋白基因成功地整合到该病菌的DNA中；所获得的转化子能稳定遗传,如继代培养7次后,仍能观察到发出绿色荧光的分生孢子和菌丝；另外,转化子的菌落形态、生长速度及其致病性与野生型菌株一致。本实验还就含有不同启动子的表达载体和不同分子量的PEG对荔枝酸腐菌转化率的影响进行研究,结果表明,含有盘梗霉属ham启动子的表达载体pHAMT35G-gfp-Hmb的转化率最高,而单转化的转化率略高于共转化；另外,PEG-MW3350的转化率比PEG-MW4400的转化率高。