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雄烯二酮（AD）是合成甾体激素类药物不可替代的中间体,随着薯芋皂素资源日渐枯竭,利用微生物发酵生产AD是目前研究的热点课题之一。菌株Mycobacterium sp.BD696—6（简称BD696-6）可转化植物甾醇为雄烯二酮,但其发酵过程中存在菌体浓度低、发酵周期长、转化率低等缺点。许多研究表明,固定化技术能有效保护细胞膜的完整性,促进目标产物的积累。本论文采用海藻酸钠包埋法和硅藻土吸附法固定菌体细胞,探索固定化条件及发酵条件对分枝杆菌BD696—6发酵产AD的影响,主要研究结果如下。在单因素试验基础上,正交实验优化得到菌株BD696—6的最适固定化条件,海藻酸钠浓度3g/100mL、CaCl2浓度1g/100mL、菌体包埋量15mL/50mL凝胶,静置固化时间1h;该条件下进行菌株BD696—6固定化细胞与游离细胞对比试验,发酵周期由168h缩短为144h,AD转化率提高了17.93%。对固定化菌株BD696—6发酵条件进行的研究结果表明,将20mL凝胶菌体混合液装入50mL转化培养基/250mL摇瓶、发酵温度32℃、初始pH8.5、摇床转速230r/min、甾醇添加量5g/L时,AD转化率最高达80.83%,且固定化细胞具有较好的贮存稳定性和可重复利用性。扫描电镜显示以海藻酸钠为包埋载体时,营养物质可自由传输。以硅藻土作为菌株BD696-6吸附载体,经吸附固定后,通过正交试验获得硅藻土吸附固定化细胞的条件为载体添加量7g/L、最佳接种量18%、甾醇添加量3g/L、发酵时间168h,AD转化率达到81.47%,比游离细胞发酵AD转化率提高了19.82%。对硅藻土吸附固定细胞发酵条件的研究表明,较适的摇床转速200r/min、发酵温度32℃、初始pH8.7、甘氨酸添加量4g/L发酵培养基,表面活性剂吐温-80对发酵影响不大,金属离子Fe2+、Zn2+、Mg2+对AD转化率有明显的促进作用,其中加入FeSO4·7H2O 0.1 g/L,AD转化率最高,其值为85.64%。5L发酵罐中进行放大试验的结果表明,以硅藻土为载体,加入甾醇5g/L时,AD转化率达到95.21%。