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小麦的紫色籽粒性状是花青素在果皮中积累造成的,由位于7BL和2AL染色体上两个互补基因Pp1和Pp3调控。Pp3编码一个MYC类的转录因子TaMyc1,而Pp1基因尚不清楚。利用序列的同源性分析,将拟南芥中与花青素合成代谢相关的转录因子及结构基因(AtCHS,AtCHI,AtF3H,AtF35H和AtANS等)与小麦基因组进行比对,发现只有CHS位于小麦染色体7BL上。因此本项研究分离了白粒小麦品种Opata和紫粒小麦品种Gy115中的7BL上的查尔酮合酶基因(TaCHS7BL),测定其表达谱,分析其表达差异的原因,并评价其在小麦紫色籽粒性状形成中的作用,获得以下研究结果: 1.Gy115和Opata TaCHS7BL编码区序列除了有三个碱基的差异外,其余序列完全一致,所编码的氨基酸序列也完全一致。TaCHS7BL编码区有1516个核苷酸,编码398个氨基酸,包含一个内含子。TaCHS7BL具有查尔酮合酶的典型特征,具有反应的活性位点,产物结合位点及丙二酰CoA结合位点。TaCHS7BL在Gy115所有组织中的表达量均高于Opata。TaCHS7BL在胚芽鞘中的表达高于在茎、叶、果皮、根中的表达,而果皮中的表达水平最低。 2.分离TaCHS7BL的5UTR区发现Opata的5UTR有81bp的插入。结构预测发现其具有非自主性转座子MITE的特征,命名为TaMITE81。TaMITE81的TIRs(terminal inverted repeats)结构有39个碱基,两侧的TSD(target siteduplications)结构由“TA”组成,TSD具有Stowaway MITE的典型特征。“AT”富含区的中心只包含三个核苷酸“AAA”。TIRs结构之间互补,有5个核苷酸的错配,在二级结构中形成茎环结构。小RNA tae-miR1121与TaMITE81的内部区域(41-62个碱基之间)有三个核苷酸的错配。tae-miR1121可能由TaMITE81同源序列产生。利用中国春缺体四体对TaMITE81进行染色体定位,发现其位于7B染色体上。由于Gy115中靶位点序列“TA”的存在,可以推测等位变异TaCHS7BLgy115可以由TaCHS7BLopata在5端非编码区删除TaMITE81产生。TaCHS7BL的等位变异TaCHS7BLgy115和TaCHS7BLopata存在于四倍体小麦和六倍体小麦中,因此这两种等位变异可能首先在四倍小麦中出现,然后分别通过异源多倍化过程在六倍体小麦中形成。 3.高原115和Opata TaCHS7BL的启动子瞬时表达实验显示,将携带有高原115TaCHS7BL启动子的重组载体用基因枪轰击进白色胚芽鞘,经GUS染液染色后,23个胚芽鞘有16个被染色。这个结果同Ubiquitin启动子重组载体相接近,它有18个被染色。然而,Ubiquitin启动子远比Gy115更活跃。用Ubiquitin启动子构建的重组载体每次轰击平均有490个细胞被染色,而Gy115的TaCHS7BL启动子只有264个。Opata的TaCHS7BL启动子构建的重组载体每次轰击平均仅仅有8个胚芽鞘被染色,这8个胚芽鞘上共有32个细胞被染色,单个胚芽鞘最多只有10个细胞被染色。说明Gy115TaCHS7BL启动子远远比Opata TaCHS7BL启动子活跃。而TaMITE81是它们之间最明显的差别,因此TaMITE81的插入是造成GUS基因在胚芽鞘中低表达的原因,从而揭示了TaMITE81的插入可能是造成Opata各组织中TaCHS7BL表达量低的原因。 4.TaCHS7BL等位变异与小麦籽粒紫色性状的关联分析结果显示,在高原115×Opata重组自交系56个紫色种子中,43个无TaMITE81的插入,13个有插入。在重组自交系135个白色种子中,91个无TaMITE81的插入,44个有插入。因此,TaCHS7BL等位变异与小麦籽粒紫色性状没有关联,TaMITE81的插入不是造成小麦紫粒的原因,该基因不是控制紫粒小麦的候选基因Pp1。 5.生物信息分析发现在普通小麦A、B、D组,乌拉尔图小麦,节节麦和大麦中均有TaMITE81的同源序列。在普通小麦中TaMITE81同源序列有4993个拷贝,而在二倍体乌拉尔图小麦,节节麦和大麦中分别只有407,386和480份拷贝,TaMITE81密度分别是0.11/M、0.12/M和0.12/M。普通小麦染色体3B上TaMITE81同源序列密度最低,为0.47/M;2D最高,为1.65/M。A、B、D组染色体上密度分别是1.19/M、0.74/M和1.32/M。A组和D组染色体上TaMITE81的密度是其染色体供体祖先乌拉尔图小麦(A组)和节节麦(D组)的10倍,很有可能异源多倍化过程造成了Ta MITE81的扩增。