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干扰素(interferon,IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子。根据IFN作用的受体不同而分为三型:Ⅰ型IFN、Ⅱ型IFN和Ⅲ型IFN,Ⅰ型包括IFN-α、β、ω、τ、κ等:Ⅱ型只有IFN γ;Ⅲ型可分为IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3。其中IFN-α、IFN-β是机体的第一抵御病毒体系。
近年来,犬类动物在人类的生活中越来越占据重要的部分,但各种疾病困扰着中国的养犬业。我国犬的传染病愈来愈复杂,在众多的病因中,病毒引起的疾病尤为严重,如犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病等。有些病毒是人畜共患病的病原。由于疫苗在使用、保存等方面原因,造成免疫程序失败,而且疫苗对传染病没有治疗作用。从兽医和人医临床的角度出发,综合控制犬病毒性疾病,需要安全、有效、副作用少的药物。干扰素具有高效的抗病毒感染、抑制肿瘤细胞生长和调节机体免疫功能的作用,作为生物药剂和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。目前已有一些基因工程干扰素产品在防治人和动物的病毒性疾病方面取得了良好的效果。因此采用重组DNA技术生产犬β干扰素作为免疫增强剂和免疫治疗剂无疑有重要意义。
具体的研究有以下几个方面:
根据GenBank上发表的犬(canine familiars)干扰素-β(Interferon-β,IFN-β)基因序列的酶切图谱和根据表达载体pPICZαC的多克隆位点的分析,设计了一对引物,上游引物P1中加入限制性内切酶EcoRⅠ位点,下游引物P2中加入了限制性内切酶KpnⅠ位点。采用PCR技术以犬肝细胞为材料,从总DNA中扩增出犬IFN-β基因。分离纯化扩增片段,克隆入pPICZαC载体,经酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析,表明扩增片段为犬IFN-β基因。测序结果显示克隆的IFN-β基因全长498个核苷酸,编码165个氨基酸,与GenBank中CaIFN-β比较,核甘酸序列相似性为100%。
通过电击将经PmeⅠ酶切后线性化的pPICZαC-IFNβ质粒转化到巴斯德毕赤酵母X33中,经ZoecinTm,抗性浓度筛选出高抗性重组菌株,用1%甲醇诱导目的蛋白表达。SDS-PAGE和Western-blotting鉴定表达产物的结果表明,分泌于胞外的犬IFN β蛋白分子量比犬IFN β理论值分子量稍大,估计是糖基化的原因。
将蛋白表达上清经细胞毒性实验检测,表达产物的抗病毒活性为3.94×105IU/L。
本研究成功实现了CaIFN-β在巴斯德毕赤酵母(Yichia pastoris)中的分泌表达。该表达蛋白能够干扰水泡性口膜炎病毒(VSV)在Vero上的复制,结果表明该蛋白在预防和治疗犬病毒性疾病方面具有潜在的应用价值。为利用基因工程手段开发重组β干扰素制剂打下了良好的基础。