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组织激肽释放酶（kallikrein，KLK）属于胰蛋白酶和糜蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶类家族。目前关于KLK家族在心血管系统中的作用主要集中于KLK1的研究，已有结果表明KLK1具有保护心脏和抗心肌肥大的作用，而此保护作用主要是通过水解激肽原生成缓激肽等激肽类物质，继而再作用于缓激肽B2受体（B2R）而完成。然而KLK家族的其他成员在心脏保护和肥大过程中的作用并不清楚。本实验室曹步清博士的研究曾发现在原代培养的乳鼠心肌细胞中，过表达KLK8可以通过促进激肽类物质的释放、继而作用于B2R从而减轻缺氧/复氧所导致的心肌细胞损伤。前期研究同时发现KLK8的过表达能够促进心肌细胞肥大，而且我们进一步研究发现过表达KLK8促进心肌细胞肥大的效应却并不能被激肽受体阻断剂所阻断，但是却能被蛋白酶阻断剂所阻断,提示KLK8促进心肌细胞肥大的作用依赖于其自身的丝氨酸蛋白酶活性，然而其具体机制仍未阐明。作为丝氨酸蛋白酶，KLK8可以水解一系列蛋白底物而产生生物学效应。已有研究表明，KLK家族的底物除了激肽原外，还包括细胞外基质（ECM）成分、表皮生长因子（EGF）前体以及蛋白酶激活受体（PAR）等，其中关于EGF和PAR在心肌细胞中的作用均有文献报道，然而KLK8是否可能通过EGF和PAR依赖的途径促进心肌细胞肥大仍未可知，因此本课题首先明确了KLK8在正常大鼠心肌肥厚模型心脏组织中的表达变化，然后采用左心室前壁注射KLK8腺病毒表达载体的方法在整体水平证实KLK8是否具有促进心肌肥厚的作用，最终在原代培养的心肌细胞中又进一步探讨KLK8是否通过EGF或PAR介导的机制促进心肌肥大。主要研究内容与结果如下：一KLK8在心脏中的表达首先我们使用免疫组化（IHC）的方法，证实在正常大鼠的心肌组织样本中确实有KLK8的表达。二KLK8在心肌肥大模型大鼠心脏组织中的表达变化已知自发性高血压大鼠（SHR）随着年龄的增加血压逐步升高，当达到16周龄的时已经发生明显的心肌肥厚。横向主动脉缩窄（TAC）大鼠在手术8周的时候也会发生明显的心肌肥厚。我们选择16周龄的SHR,以及TAC术后8周的这两个时间点的大鼠作为研究心脏肥大的整体模型。Real time PCR结果显示SHR和TAC大鼠心肌组织中，心肌肥大标志物ANP和Myh7mRNA表达水平较之对照组显著增多。表明SHR和TAC大鼠心脏模型构建成功。通过对SHR和TAC大鼠的心肌样本检测发现。 SHR大鼠心肌组织中KLK8的mRNA和蛋白表达较之对照WKY组均显著增加。同时TAC大鼠心肌组织中KLK8的mRNA和蛋白表达增加分别约为对照组的2.5倍和2倍。上述的结果显示：心肌肥厚大鼠心肌组织中KLK8表达显著增多。三心脏局部KLK8过表达促进心肌肥厚在SHR和TAC这两种心肌肥厚的大鼠模型中，KLK8的mRNA和蛋白表达水平较之对照组都有着明显升高，提示KLK8可能参与了心肌肥厚发生过程。因此我们构建了KLK8腺病毒，并采用左心室前壁局部注射的方式进一步研究了心脏局部KLK8过表达对于心肌组织结构和功能的影响。1.KLK8腺病毒（Ad-KLK8）注射后左心室前壁KLK8蛋白表达水平显著增加。2.通过Real time PCR检测发现，Ad-KLK8注射组心脏中ANP和Myh7mRNA表达显著升高。3.Masson染色的结果显示，与注射空载体腺病毒（Ad-vector）组相比，注射Ad-klk8大鼠的纤维化水平没有显著的改变；然而使用免疫组化的方法标记细胞膜的层粘连蛋白后发现注射Ad-klk8的大鼠心肌细胞横截面积显著增加。4.超声心动图检测发现与注射空载体腺病毒（Ad-vector）的对照组相比，注射Ad-KLK8大鼠的收缩和舒张期的左心室前壁厚度(LVAWs、LVAWd)、射血分数（%EF）以及短轴缩短率（%FS）都显著的增加；左心室收缩和舒张末期时的直径（LVIDs、LVIDd）、左心室收缩和舒展末期时的容积（LVs、LVs）都显著的减少，但是左心室收缩和舒张末期时后壁的厚度（LVPWs、LVPWd）以及大鼠心脏重和体重的比值（HW/BW）并没有发生明显的变化。以上的研究结果表明，在大鼠心脏局部过表达KLK8能够显著促进心肌肥厚，进而导致心脏收缩功能增强。四KLK8促进心肌细胞肥大的作用及其机制本实验室前期研究已经证实KLK8具有促进心肌细胞肥大的作用，该作用并不依赖于缓激肽受体，但是可以被丝氨酸蛋白酶抑制剂所阻断。已有研究表明EGF前体和PAR可能是KLK8的底物，因而在这一部分研究中我们主要探讨了EGF和PAR是否介导了KLK8促进心肌细胞肥大的作用。1.EGF参与了KLK8促进心肌细胞肥大的作用将Ad-KLK8感染原代培养的新生鼠心肌细胞，结果发现：过表达KLK8能够导致ANP和Myh7这两个心肌细胞肥大标志物的mRNA表达显著升高，同时心肌细胞的总的蛋白含量以及细胞形态大小也都明显的增加，说明KLK8可以促进心肌细胞肥大。同时，KLK8过表达可以显著提高培养上清中EGF的含量，并且KLK8的这种效应可以被丝氨酸蛋白酶活性抑制剂antipain和ZnSO4所逆转。此外，EGF受体阻断剂（AG1478）和小干扰RNA片段(EGFR siRNA)均可显著逆转KLK8的促心肌细胞肥大的效应。上述实验结果提示：KLK8可能是通过促进EGF生成、激活EGF受体而起到促进心肌细胞肥大的作用。2.PAR激活参与了KLK8促进心肌细胞肥大的作用PARs是一种G蛋白偶联受体，其中PAR1、PAR2和PAR4广泛分布于心血管系统，有学者在血管平滑肌细胞中也发现，血浆激肽释放酶可通过不依赖于缓激肽受体的方式激活PAR1/2，继而激活MAPKs（ERK1/2和JNK）途径而发挥效应。我们在原代培养心肌细胞中分别加入Ad-KLK8以及PAR1或PAR2受体的阻断剂（RWJ56110、FSLLRY-NH2）和小干扰RNA片段(PAR1siRNA、PAR2siRNA)孵育。结果发现：Ad-KLK8能够诱导ANP和Myh7这两个心肌细胞肥大标志物的mRNA表达水平显著升高，同时心肌细胞的总蛋白含量也明显增加。而PAR1和PAR2的阻断剂和siRNA均能显著逆转Ad-KLK8的促心肌肥大的效应。上述实验结果提示KLK8可能是通过激活PAR1和PAR2而起到促进心肌细胞肥大的作用。结论：本课题的研究结果显示，心肌肥厚大鼠模型心肌组织中KLK8表达显著增多；左心室前壁局部KLK8过表达可以促使左心室前壁心肌细胞横截面积显著增加、心肌肥厚、左心室射血能力增强；KLK8促进心肌细胞肥大的效应可能与其促进EGF释放和PAR1/2激活的作用有关。