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谷胱甘肽(L-Glutathione,简称GSH),化学名:γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸-甘氨酸(γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine),是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的三肽化合物。GSH是一种广泛存在于动、植物和微生物细胞中的具有重要生理活性的活性三肽,在蛋白质和DNA的合成、物质的运输、酶的活性、新陈代谢及细胞的保护等方面具有直接或间接作用。GSH主要在医药和食品两大领域具有广泛用途。GSH的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、酶转化法和发酵法。目前国内关于GSH的研究主要集中在菌种选育、培养基和发酵条件优化、分离提取和在临床应用上,而关于发酵生产谷胱甘肽的代谢调控和动力学研究则较少。
(1)研究了在不同发酵阶段添加不同浓度的前体氨基酸对酿酒酵母YF(ZnCl2r,Ethr)发酵生产GSH的影响。结果表明分别添加低浓度(2mmol/L左右)的L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三种前体氨基酸对酿酒酵母突变株YF的细胞生长都会有促进作用,但浓度大于4mmol/L时则呈现抑制作用。L-半胱氨酸对酿酒酵母突变株YF发酵生产GSH影响最大,L-谷氨酸影响次之,甘氨酸影响最小。经正交实验优化后,添加混合前体氨基酸可以显著提高谷胱甘肽浓度。
(2)研究了非前体氨基酸对酿酒酵母YF(ZnCl2r,Ethr)发酵生产GSH的影响。结果表明在稳定期添加3mmol/L的非前体氨基酸,对酿酒酵母突变株YF的细胞干重基本无影响。除L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-丙氨酸和L-甲硫氨酸这五种氨基酸可以促进谷胱甘肽合成外,其它氨基酸对谷胱甘肽合成无显著影响。在发酵22h添加L-甲硫氨酸5mmol/L时可以使谷胱甘肽浓度达到142.68mg/L,比空白对照增大了66.8％。
(3)通过破碎酵母细胞后向反应液中加入前体氨基酸和ATP的方法,研究抑制谷胱甘肽合成相关酶活性的因素。结果显示:谷胱甘肽浓度在13mmol/L以上时,谷胱甘肽对GSHⅠ抑制作用明显。同时ADP与ATP的比对GSHⅠ和GSHⅡ两种酶都有影响,趋势为ADP与ATP的比越大,对GSHⅠ和GSHⅡ的抑制作用越大。
(4)使用Design Expert软件的Plackett-Burman设计法筛选出了影响5L发酵罐中谷胱甘肽生物合成的三个主要因素,响应面分析法表明这三个因素最佳水平值为:搅拌转速187r/min,通气量246L/h,pH值6.36。利用Originpro8.0软件对分批发酵的菌体干重、谷胱甘肽浓度和发酵液中糖浓度实验值进行拟合,得到细胞生长动力学模型、产物生成动力学模型和基质消耗动力学模型。模型分析和实验验证结果表明该模型拟合效果好,具有较高的稳定性。
(5)研究了5L发酵罐中分批补加葡萄糖生产GSH的条件,结果表明补料分批发酵至33h时GSH浓度达到72.49mg/L,细胞干重达到28.52g/L,分别为初糖20g/L分批培养方式的2.86倍和4.93倍。构建了补料分批发酵阶段细胞生长动力学模型、产物生成动力学模型和基质消耗动力学模型,应用统计软件Originpro8.0对模型参数进行了求取。经模型分析和实验验证模型的效果较好。