论文部分内容阅读
涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是一种罕见的恶性头颈部肿瘤，具有生长不可预测、广泛的神经周围浸润（perineural invasion，PNI）和高转移率等特点，然而，其详细的发病及转移机制仍不清楚。以往的主要研究集中在肿瘤细胞本身基因和表观遗传发生的改变，近年来，癌细胞与肿瘤微环境中存在的基质之间的交互作用受到极大的重视，并积累了越来越多的研究数据。作为肿瘤的主要基质成分，肿瘤相关的成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）在肿瘤微环境中通过促进肿瘤细胞增殖、血管生成、炎症的形成和肿瘤转移来促进肿瘤的恶性转化过程。外泌体作为脂质双层膜结构的囊泡，其中包含DNA、RNA、蛋白质、脂质等多种生物活性成分，通过接触的方式在细胞间传递，在生理及病理条件下均发挥着重要作用，影响着主要的肿瘤相关通路，已成为细胞间联系的关键介质，目前对于SACC细胞来源外泌体的研究鲜有报道，本研究的目的是探索外泌体介导的SACC与成纤维细胞之间的作用和联系。
我们选用人涎腺腺样囊性癌 SACC-83 细胞株，提取肿瘤细胞来源的外泌体，通过Western blot检测其标志性蛋白表达，利用电镜技术进一步验证其纯度；接着我们用共聚焦显微镜观察 SACC-83 细胞来源的外泌体被人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblast,HPLF）内化的作用。进一步利用外泌体处理HPLF细胞，通过Realtime PCR技术检测HPLF细胞中炎症相关因子（MCP-1、iNOS、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α）和趋化相关因子及受体（CXCR4、CXCL12、BDNF、NTF4、NGF和NTRK1）水平的变化情况，同时我们利用外泌体处理HPLF细胞培养的上清刺激SACC-83细胞，通过Transwell小室和划痕实验观察其侵袭迁移的情况；进一步应用转录组RNA测序技术检测SACC-83细胞来源的外泌体处理HPLF细胞的基因变化，通过Western blot和ELISA技术检测外泌体处理HPLF细胞中NGF蛋白的表达和分泌水平，利用Transwell小室实验观察NGF阻断抗体是否抑制外泌体处理 HPLF 细胞培养上清液对 SACC-83 细胞侵袭的增强作用，通过生物信息学网站Oncomine分析了NGF受体NTRK1在SACC中的表达情况，同时我们也利用免疫组化方法检测了NTRK1在SACC临床样本中的表达情况。
结果显示，我们成功分离得到 SACC-83 细胞来源的外泌体；该外泌体以时间依赖的方式进入 HPLF 细胞，随着时间延长，转移到 HPLF 细胞的外泌体也增多。同时，这些外泌体进入HPLF细胞也与剂量有关，随着剂量的增加，转移到HPLF细胞的外泌体也增多；Transwell小室和划痕实验结果显示，经外泌体处理过的HPLF细胞的培养上清孵育24小时后，SACC-83细胞的侵袭能力显著增高；Realtime PCR结果显示，外泌体刺激能够显著促进HPLF细胞中炎症相关因子MCP-1、iNOS、IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的表达，同时趋化相关因子及受体，包括 CXCR4、BDNF、NGF和NTRK1 mRNA水平也明显增高。利用全转录组测序技术，通过BGISEQ-500平台一共检测了两个处理组共6 个样品（每组3个样品），其中每个样品获得平均21.89 兆的数据。样品与基因组之间的平均比对率为 93.67% ，同时比对基因集的平均比对率为88.03%；最终检测到 17,648个基因，其中两组间有943个基因的表达水平出现两倍以上的差异。差异基因GO富集分析显示，细胞因子、细胞因子受体结合以及细胞因子介导的信号通路涉及的基因表达差别最大；差异表达基因KEGG通路分析涉及7个分支，包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢、有机系统和药物开发，其中涉及信号传导和免疫系统通路的差异基因最多，进一步KEGG 通路富集分析显示，其中涉及TNF-α信号通路、胞质DNA感受通路、NF-kappa B信号通路、细胞因子和受体相互作用的差异基因最多。利用Western blot和ELISA技术检测蛋白质的表达水平，结果提示HPLF细胞经外泌体处理后 NGF蛋白水平表达显著增高，其分泌的NGF蛋白水平也相应明显升高。通过Transwell小室实验我们进一步发现，应用NGF中和性抗体可以明显降低HPLF细胞经外泌体处理后的培养上清液对 SACC-83 细胞侵袭的促进作用。通过生物信息学Oncomine网站分析显示，NGF受体NTRK1在SACC中表达显著增高，我们进一步通过免疫组化技术证实NTRK1在临床样本SACC中表达明显升高。
结论：SACC-83分泌的外泌体能够被成纤维细胞HPLF内吞，促进HPLF细胞炎症相关因子、趋化因子及相关受体的表达增高，其处理后的培养上清进一步促进SACC-83细胞的侵袭，中和NGF蛋白能够明显抑制此促进作用；生物信息学分析和临床SACC样本检测结果显示NGF受体NTRK1在SACC中表达显著增高。本研究证实 SACC-83 细胞来源的外泌体作用于成纤维细胞 HPLF ，进一步通过NGF-NTRK1途径促进SACC细胞的侵袭，因此，外泌体、肿瘤相关成纤维细胞及NGF-NTRK1途径可能是SACC新的潜在治疗靶点。
我们选用人涎腺腺样囊性癌 SACC-83 细胞株，提取肿瘤细胞来源的外泌体，通过Western blot检测其标志性蛋白表达，利用电镜技术进一步验证其纯度；接着我们用共聚焦显微镜观察 SACC-83 细胞来源的外泌体被人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblast,HPLF）内化的作用。进一步利用外泌体处理HPLF细胞，通过Realtime PCR技术检测HPLF细胞中炎症相关因子（MCP-1、iNOS、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α）和趋化相关因子及受体（CXCR4、CXCL12、BDNF、NTF4、NGF和NTRK1）水平的变化情况，同时我们利用外泌体处理HPLF细胞培养的上清刺激SACC-83细胞，通过Transwell小室和划痕实验观察其侵袭迁移的情况；进一步应用转录组RNA测序技术检测SACC-83细胞来源的外泌体处理HPLF细胞的基因变化，通过Western blot和ELISA技术检测外泌体处理HPLF细胞中NGF蛋白的表达和分泌水平，利用Transwell小室实验观察NGF阻断抗体是否抑制外泌体处理 HPLF 细胞培养上清液对 SACC-83 细胞侵袭的增强作用，通过生物信息学网站Oncomine分析了NGF受体NTRK1在SACC中的表达情况，同时我们也利用免疫组化方法检测了NTRK1在SACC临床样本中的表达情况。
结果显示，我们成功分离得到 SACC-83 细胞来源的外泌体；该外泌体以时间依赖的方式进入 HPLF 细胞，随着时间延长，转移到 HPLF 细胞的外泌体也增多。同时，这些外泌体进入HPLF细胞也与剂量有关，随着剂量的增加，转移到HPLF细胞的外泌体也增多；Transwell小室和划痕实验结果显示，经外泌体处理过的HPLF细胞的培养上清孵育24小时后，SACC-83细胞的侵袭能力显著增高；Realtime PCR结果显示，外泌体刺激能够显著促进HPLF细胞中炎症相关因子MCP-1、iNOS、IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的表达，同时趋化相关因子及受体，包括 CXCR4、BDNF、NGF和NTRK1 mRNA水平也明显增高。利用全转录组测序技术，通过BGISEQ-500平台一共检测了两个处理组共6 个样品（每组3个样品），其中每个样品获得平均21.89 兆的数据。样品与基因组之间的平均比对率为 93.67% ，同时比对基因集的平均比对率为88.03%；最终检测到 17,648个基因，其中两组间有943个基因的表达水平出现两倍以上的差异。差异基因GO富集分析显示，细胞因子、细胞因子受体结合以及细胞因子介导的信号通路涉及的基因表达差别最大；差异表达基因KEGG通路分析涉及7个分支，包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢、有机系统和药物开发，其中涉及信号传导和免疫系统通路的差异基因最多，进一步KEGG 通路富集分析显示，其中涉及TNF-α信号通路、胞质DNA感受通路、NF-kappa B信号通路、细胞因子和受体相互作用的差异基因最多。利用Western blot和ELISA技术检测蛋白质的表达水平，结果提示HPLF细胞经外泌体处理后 NGF蛋白水平表达显著增高，其分泌的NGF蛋白水平也相应明显升高。通过Transwell小室实验我们进一步发现，应用NGF中和性抗体可以明显降低HPLF细胞经外泌体处理后的培养上清液对 SACC-83 细胞侵袭的促进作用。通过生物信息学Oncomine网站分析显示，NGF受体NTRK1在SACC中表达显著增高，我们进一步通过免疫组化技术证实NTRK1在临床样本SACC中表达明显升高。
结论：SACC-83分泌的外泌体能够被成纤维细胞HPLF内吞，促进HPLF细胞炎症相关因子、趋化因子及相关受体的表达增高，其处理后的培养上清进一步促进SACC-83细胞的侵袭，中和NGF蛋白能够明显抑制此促进作用；生物信息学分析和临床SACC样本检测结果显示NGF受体NTRK1在SACC中表达显著增高。本研究证实 SACC-83 细胞来源的外泌体作用于成纤维细胞 HPLF ，进一步通过NGF-NTRK1途径促进SACC细胞的侵袭，因此，外泌体、肿瘤相关成纤维细胞及NGF-NTRK1途径可能是SACC新的潜在治疗靶点。