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研究背景及目的癌症已经成为全球危害人类健康的首要因素,在女性中,乳腺癌的发病率和死亡率都居于首位,在男性中,前列腺癌的发病率排名第二,死亡率排名第五。在国内,乳腺癌和前列腺癌的发病率和死亡率排名都位于前十。遗传变异是导致癌症风险的重要因素。通过全基因组关联分析（GWAS）已经发现大量与癌症风险相关的单核苷酸多态性（SNP）位点,其中乳腺癌风险相关SNP位点已经超过2000个,前列腺癌风险相关位点已经超过1000个。然而,这些SNP位点大多数位于基因的非编码区,不直接影响基因的编码,为其功能和机制研究带来了很大的困难。由于这些变异通常造成基因调控的异常,因此我们急需一种高效的并行报告基因分析系统,来鉴定具有基因调控功能的SNP位点。目前,以10-20个核苷酸DNA序列作为条形码标签的高通量报告基因分析系统已经得到广泛应用,例如MPFD,MPRA等,然而这些条形码的核苷酸组成会不可避免的给报告基因分析结果带来偏差。在大规模并行报告基因分析中,为了减少条形码碱基组成偏好性带来的影响,通常需要给每个DNA片段分配30-100个条形码,这大大增加了文库和数据处理的复杂性。因此我们亟需一种具有高精确度、高稳定性、低偏好性和低复杂性的并行报告基因分析系统。本论文研究的主要目的是发展一种高效的低复杂性并行报告基因分析系统,并将该系统用于乳腺癌和前列腺癌风险相关位点的基因调控功能分析,鉴定具有基因调控活性的功能性变异位点,进一步对这些功能性风险位点导致癌症风险的机制进行深入的探究,为理解这些癌症风险位点导致疾病的机制以及推动这些变异位点在临床治疗中的应用提供有力证据和支持。研究结果1.双核苷酸报告基因分析系统的构建为了高效筛选具有生物调控活性的风险SNP,我们发展了一种双核苷酸报告基因分析系统（DiR）。通过对pGL3-Promoter载体的荧光素酶编码序列进行改造,去除起始密码子,以避免报告基因翻译给宿主细胞带来的压力,然后截取部分荧光素酶编码序列并进行碱基优化,得到了 450bp设计双核苷酸条码的DNA区域。同时,为了使报告基因分析系统也能够通过qPCR技术对报告基因表达水平进行定量,我们确定了一套双核苷酸条形码的编码规则,使用条码特异性引物即可通过qPCR对报告分子进行定量。通过定点突变的方法在450bp长度的报告基因序列上引入双核苷酸条码,获得了报告基因载体文库。目前该报告基因分析系统包含628个报告质粒,可以实现628个等位基因的并行分析。分析表明,与常用的10核苷酸条形码相比,双核苷酸条码具有较低的碱基组成偏好性,可以更准确的反映DNA元件的基因调控活性。与传统荧光素酶报告基因分析系统相比,双核苷酸报告基因分析系统可实现大量位点的并行分析,使报告基因分析实验更加高效。并且,可使用条码特异性引物通过定量PCR检测报告基因的表达水平,兼顾了常规通量报告基因分析方便快捷的优点。DiR系统通过去除起始密码子免除了报告基因翻译过程以及蛋白产物对宿主细胞可能带来的压力,能更真实的反映基因调控元件的活性水平。DiR具有更高的报告基因表达水平,以及更好的稳定性,因此对于基因调控活性较低的DNA元件,比如功能性SNP位点,具有更大的灵敏度和稳定性优势。因此,该双核苷酸报告基因分析系统能准确鉴定具有基因调控活性的风险位点,使功能性癌症相关风险SNP位点的筛选变得更加高效,为癌症风险位点的功能及调控机制研究打下坚实的基础。2.乳腺癌风险SNP位点的报告基因分析及功能机制研究我们在9种乳腺癌细胞中对288个乳腺癌风险相关位点进行了 DiR-seq分析,进一步结合ChIP-seq,ATACs-seq等多组学分析,鉴定出七个具有调控功能的乳腺癌风险SNP位点,包括rs11552449,rs3750817,rs1092913,rs10822013,rs4808611,rs62314947和rs2236007,这些位点相关基因的表达水平与乳腺癌患者的生存概率具有显著的相关性。其中,风险位点rs4808611的基因调控活性表现出了显著的等位基因特异性,C等位基因的活性显著大于T等位基因的活性。FAIRE分析发现,该位点所在染色质区域在多种乳腺癌细胞系中均处于较高的开放状态。H3K27ac和H3K4me3的ChIP分析表明,rs4808611显著富集于组蛋白活性修饰谱中,并且该位点在FAIRE DNA和ChIP DNA中的富集具有显著的等位基因选择性。rs4808611位于基因NR2F6的内含子上,在乳腺癌细胞系中敲除rs4808611位点区域会显著降低靶基因NR2F6的表达水平。进一步在乳腺癌患者中的生存分析表明,NR2F6基因的高表达与乳腺癌患者的不良预后高度相关。另外,风险位点rs2236007的基因调控活性也表现出了显著的等位基因特异性,A等位基因的活性显著大于G等位基因的活性。FAIRE实验和ChIP实验分析发现,该位点所在染色质区域在多种乳腺癌细胞系中表现出较高的开放状态,并且明显富集于活性标记组蛋白修饰谱中。不管是在FAIRE DNA还是在ChIP DNA中,rs2236007位点的富集都表现出了显著的等位基因选择性。进一步,针对该位点的CRISPR激活实验显著上调了靶基因PAX9的表达水平,而敲除该位点区域则下调了PAX9基因的表达,表明PAX9可能是rs2236007调控的靶基因。转录因子预测分析发现,该位点区域是一个典型的转录因子EGR1结合位点,且对G等位基因有较高的选择性。并且,在乳腺癌细胞系中敲低EGR1 调了PAX9的表达水平,而过表达EGR1则显著降低了PAX9基因的表达水平。通过对乳腺癌患者生存分析发现,PAX9基因的低表达与乳腺癌患者的不良预后显著相关。我们认为,rs2236007位点G等位基因通过结合转录抑制因子EGR1下调靶基因PAX9的表达水平,从而导致乳腺癌患者的不良预后和恶性进展。3.前列腺癌风险SNP位点的报告基因分析及功能机制研究我们在前列腺癌细胞系22Rv1中对213个前列腺癌风险相关SNP位点进行了 DiR-seq分析,鉴定了 32个具有基因调控活性的功能SNPs。其中,rs684232位点T等位基因的报告基因活性显著大于C等位基因。该位点在FAIRE实验中显著富集于开放染色质中,且T等位基因的开放程度显著高于C等位基因。针对组蛋白修饰的ChIP实验表明,该位点位于H3K27ac和H3K4me3修饰谱中,并且两种组蛋白修饰都对T等位基因表现出了显著的等位基因选择性。针对转录因子FOXA1的ChIP分析发现,rs684232位点T等位基因促进了 FOXA1在染色质上的结合。使用GTEx数据库中前列腺组织样本进行的eQTL分析发现,VPS53、FAM57A和GEMIN4三个基因的表达水平均与rs684232位点的基因型显著相关,并且T/T基因型高于C/C基因型的表达水平。进一步实验表明,在前列腺癌细胞22Rv1中敲除rs684232位点或者敲低转录因子FOXA1均可显著下调VPS53、FAM57A和GEMIN4基因的表达水平,此外,在前列腺癌组织样本的转录组数据中,VPS53、FAM57A和GEMIN4基因表达水平显著高于正常癌旁组织,并且转录因子FOXA1的表达水平与这三个基因之间均呈现出高度的相关性。在前列腺癌患者中进行的生存分析表明,VPS53、FAM57A和GEMIN4基因高表达的病人具有更短的生存期。综上所述,rs684232位点的T等位基因可以选择性结合转录因子FOXA1,促进三个靶基因VPS53、FAM57A和GEMIN4的表达,进而促进前列腺癌的恶性发展。研究结论我们发展的双核苷酸报告基因分析系统实现了功能性癌症风险SNP的大规模筛选,与传统的荧光素酶报告基因分析系统相比,不仅通量高,而且具有更高的灵敏度和稳定性。与现有的并行报告基因分析系统相比,受DNA条码偏好性影响较小,能更真实的反映出变异位点的基因调控活性,准确鉴定出具有调控活性的SNP位点。我们将双核苷酸报告基因分析系统应用于乳腺癌和前列腺癌风险位点的筛选工作,鉴定了多个功能性风险SNP位点,并对其中三个位点的功能和机制开展了系统的研究。rs4808611与rs2236007是乳腺癌风险相关的SNP位点,其功能和作用机制尚不清楚。我们的研究表明,rs4808611位点的C等位基因促进了NR2F6的表达,进而导致乳腺癌患者的不良预后。rs2236007位点的G等位基因通过结合转录抑制因子EGR1下调PAX9基因的表达,进而促进乳腺癌恶性进展。rs684232是前列腺癌风险相关的调控性位点,其T等位基因可促进转录因子FOXA1在染色质上的结合,上调三个靶基因VPS53、FAM57A和GEMIN4的表达,促进前列腺癌的恶性发展。本论文的研究工作致力于癌症风险相关变异位点的功能和机制研究,能够促进GWAS位点的功能注释,加深我们对这些位点导致疾病风险机制的理解,为癌症的风险评估、诊断和治疗提供重要证据和支持,从而促进癌症精准医疗的发展。