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研究背景骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是最常见的一种与年龄相关的慢性关节疾病,并且随着人群寿命逐渐延长和老龄化逐渐加重,在全球范围内变得越来越流行。以往研究表明骨性关节炎是一种多因素的退行性关节疾病,目前该病发病率极高,并且会导致身体残疾、生活质量下降和生活成本增加等一系列问题。现有研究认为OA是以慢性进行性软骨退变为主要病理表现,伴有临近骨组织的非正常重塑及骨赘形成,并同时累及半月板、滑膜、脂肪等多种组织的全关节疾病。在这其中,关节软骨作为关节中的重要组成部分,发挥支撑及分散电荷负载等重要功能,其结构完整性在OA中遭到严重破坏。软骨细胞作为软骨组织中的唯一细胞成分,具有分泌软骨基质和维持软骨表型的重要功能,多种因素包括与年龄相关的衰老以及外界各种应激事件（如创伤和辐射等）可通过激活炎症及活性氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）等途径引起软骨细胞衰老,并伴随一系列衰老相关改变,如肥大化,增殖分化能力减弱甚至丧失,这些改变均会阻碍机体自身的软骨修复,逐步导致软骨降解,并最终演变为OA。由此可见,软骨细胞的衰老在OA的发生发展中扮演着重要的角色。研究表明,细胞衰老的主要表现是生长周期停滞、代谢改变以及增殖能力丧失,与细胞衰老有关的标志物包括衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）、衰老相关异质染色体、p53,p21和p16的表达上调。细胞衰老可由机体的衰老引起,同时也可以促进组织的衰老。在创伤导致的OA中,p16INK4a阳性的衰老软骨细胞会在软骨组织中逐渐累积,同时会过度分泌各种细胞因子（如白细胞介素1和6）和生长因子（如表皮生长因子、转化生长因子）和基质降解酶（如基质金属蛋白酶（MMPs）等）,上述特征也被称为衰老相关分泌表型（SASP）。随着SASP持续分泌,会逐渐形成关节内衰老微环境（intra-articular senescent microenvironment,IASM）,使周围正常软骨细胞加速衰老,显著抑制软骨祖细胞及间充质干细胞的增殖分化能力,加剧OA的进展。另有研究发现,衰老细胞相较正常细胞具有更强的抵御外界不良刺激的能力,其自身具有的抗凋亡生存机制（如抗凋亡蛋白BCL-2,BCL-xl表达上调）使其能够抵抗凋亡及SASP的影响,在炎性及衰老微环境中继续存活。研究发现,通过转基因手段靶向清除早衰小鼠膝关节内荧光标记的p16INK4a阳性衰老细胞可以减轻关节腔炎症同时延缓创伤性OA的进展,但此转基因方法操作较为复杂且涉及伦理问题。最新研究发现的一类新型小分子药物“senolytics”可以选择性清除衰老细胞,获得与转基因方法相似的效果。Navitoclax（也称为ABT263）作为一种近些年发现的新型senolytic药物,能特异性抑制抗凋亡蛋白BCL家族中的BCL-2、BCL-xl及BCL-w蛋白,激活Caspase信号通路从而诱导细胞凋亡。研究发现ABT263能选择性清除经全身电离辐照（Total-body irradiation,TBI）诱导的早衰小鼠造血系统中的衰老造血干细胞,从而增强早衰小鼠身体中的干细胞功能,恢复组织活力。已有文献报道,ABT263可诱导癌细胞凋亡而被用于治疗淋巴细胞白血病及小细胞肺癌,但其在骨关节炎中的应用研究未见报道。针对这一问题,本课题主要针对ABT263能否通过诱导细胞凋亡的方式选择性清除OA关节软骨组织中的衰老细胞以从而改善OA炎症环境这一问题进行探究。我们首先验证了ABT263能有效清除经电离辐射（IR）诱导的衰老大鼠软骨细胞,然后我们研究了ABT263对二维及三维培养下的OA软骨细胞中SASP表达的影响,证明其能通过诱导衰老细胞凋亡改善炎症微环境。此外,我们还验证了关节内注射ABT263可减轻Sprague-Dawley（SD）大鼠膝关节创伤性骨性关节中的软骨及软骨下骨损伤。目的:本研究以大鼠和人OA软骨及软骨细胞为模型,探讨Navitoclax（ABT263）通过清除骨关节炎中衰老软骨细胞从而发挥减轻炎症及减少软骨破坏的作用及其可能的细胞和分子机制。方法:第一部分:ABT263对正常软骨细胞活性的影响及对衰老软骨细胞清除效率的探究1、原代软骨细胞的分离提取及扩增首先从全膝关节置换术中获取人OA关节软骨块组织,并根据以往文献方法提取人原代OA软骨细胞。参考以往文献方法,从SD大鼠关节软骨组织中提取分离原代软骨细胞。两种原代软骨细胞均在体外培养扩增,并采用特殊染色对软骨细胞进行形态学鉴定,将原代和P1代细胞用于后续体外实验。2、电离辐照（ionization irradiation,IR）诱导衰老大鼠软骨细胞为了建立体外衰老软骨细胞模型,采用x射线辐照法诱导大鼠软骨细胞衰老。原代软骨细胞在一定条件下辐照,照射后细胞继续培养3天,接着按1:3传代,传代后继续培养7天,随后采用SA-β-gal染色、结晶紫染色和q PCR验证其衰老相关表型。3、ABT263对正常大鼠软骨细胞活性的影响为探究ABT263对正常软骨细胞是否具细胞毒性作用,采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测两组不同浓度梯度的ABT263处理正常大鼠软骨细胞24小时、48小时以及72小时的细胞活性,设置两组不同的浓度梯度,以明确ABT263产生细胞毒性作用的浓度范围。4、ABT263对辐照诱导的衰老软骨细胞的清除效率探究为了研究ABT263对辐照诱导的衰老软骨细胞的清除效率,采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）对ABT263处理24小时、48小时以及72小时后的细胞增殖-毒性作用进行检测。采用相差显微镜观察并比较衰老软骨细胞在不同浓度ABT263影响下的细胞生长状况,并采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并对凋亡细胞比例进行统计分析。第二部分:ABT263改善人OA软骨细胞炎症微环境并维持细胞表型的研究1、研究人OA软骨组织及原代OA软骨细胞中的衰老细胞从全膝关节置换术中获取OA软骨组织块,选取退变严重部位的软骨与非负重部位外观近似正常的软骨组织进行切片,并提取原代OA软骨细胞,随后采用SA-β-gal染色、HMGB1免疫组化染色对OA软骨块及原代软骨细胞中的衰老细胞进行评价。2、不同浓度ABT263对micromass culture的OA软骨细胞的影响为探究ABT263对OA软骨细胞的适宜浓度,采用micromass方法培养OA软骨细胞21天,用不同浓度的ABT263分别处理3天和10天。后者在处理3天后更换普通培养基继续培养一周,随后用SA-β-gal染色检测其中衰老细胞情况。3、ABT263对monolayer culture及pellet culture中炎症微环境的影响OA软骨细胞用ABT263处理3天后立即进行检测,另一组继续培养1周后于第10天进行评估。随后应用SA-β-gal染色、流式细胞仪、免疫荧光检测其中衰老细胞及细胞凋亡情况。应用q PCR及western blot检测其中炎症因子表达。OA软骨细胞及骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）pellet culture 21天后进行免疫组化染色评估,并用q PCR及western blot定量检测细胞微球中衰老基因及炎症因子的m RNA及蛋白表达水平。4、ABT263对monolayer culture及pellet culture中软骨细胞表型的影响OA软骨细胞在ABT263处理后第3天和10天,以及应用pellet culture体系培养OA软骨细胞及BMSC 21天后,分别应用q PCR及western blot方法对COLII、ACAN及SOX9的m RNA水平及蛋白表达进行检测,以探究ABT263对软骨细胞表型及干细胞成软骨分化的影响。第三部分:关节腔注射ABT263削弱大鼠创伤性骨关节炎软骨及软骨下骨破坏并减轻炎症1、DMM手术建立大鼠创伤性骨关节炎模型选取4-6周龄的雄性SD大鼠,通过切断其内侧半月板胫骨韧带,建立内侧半月板失稳（Destabilization of the medial meniscus,DMM）的OA模型。假手术（sham）组采用内侧切口暴露膝关节腔,然后用缝线封闭切口。于术后4周进行关节腔注射。2、关节腔内注射ABT263及对软骨的组织学评价为探究ABT263在大鼠关节腔内的适宜浓度,DMM术后4周采用不同浓度（0.25、1和5 u M）的ABT263进行大鼠膝关节腔注射。每周注射两次,连续给药两周,随后应用H&E和Safranin O/fast green染色评价实验组和对照组膝关节情况并进行组织学评分。3、离体大鼠膝关节micro-CT扫描、免疫组化染色及RT-q PCR检测在4次关节腔注射结束后,将实验大鼠处死并进行取材固定。取大鼠全膝关节进行micro-CT扫描及三维重建评估软骨下骨损伤情况。应用免疫组化染色和q PCR定性定量分析关节软骨中衰老相关基因、炎症因子和软骨基质蛋白的表达情况,探究ABT263在大鼠关节腔内的生物学效应。结果:第一部分:ABT263对正常软骨细胞活性的影响及对衰老软骨细胞清除效率的探究1、一定浓度范围内的ABT263对正常大鼠软骨细胞无细胞毒性作用CCK-8结果显示,ABT263浓度在2.5 u M内对正常大鼠软骨细胞无细胞毒性作用。对OA软骨细胞而言,ABT263在浓度小于3 u M时没有展现出明显的细胞毒性作用。2、ABT263对辐照诱导的衰老软骨细胞具有浓度依赖的清除作用经x射线辐照后的大鼠软骨细胞展现出细胞衰老的相关特征,胞浆中出现大量SA-β-gal阳性染色,殖能力明显减弱,衰老相关基因的表达明显增高。CCK-8结果显示,ABT263对衰老大鼠软骨细胞的细胞活性具有明显抑制作用,且随浓度增高,抑制效应越强。相差显微镜观察与流式细胞检测提示,ABT263通过促进衰老软骨细胞凋亡发挥对Sn Cs的清除作用,且清除效应随浓度增加而增强。第二部分:ABT263改善人OA软骨细胞炎性微环境并维持细胞表型的研究1、人OA软骨组织中存在一定比例的SA-β-gal阳性衰老细胞SA-β-gal染色提示晚期OA软骨组织和原代OA软骨细胞中存在SA-β-gal阳性的衰老细胞,组化染色结果提示HMGB1在晚期OA软骨组织中表达减弱,部分于软骨细胞核外表达。2、2.5 u M和5 u M ABT263能有效清除micromass culture中的衰老软骨细胞OA软骨细胞micromass culture 21天后用不同浓度的ABT263分别处理3天和10天,SA-β-gal染色结果提示仅2.5和5.0 u M浓度的ABT263能够有效清除SA-β-gal阳性Sn Cs,较低浓度的ABT263对SA-β-gal阳性Sn Cs无明显清除作用。3、ABT263促进衰老软骨细胞凋亡并改善二维及三维培养中的OA炎性微环境SA-β-gal染色、HMGB1荧光结果提示ABT263显著降低OA软骨细胞中的Sn Cs比例,并在一周后持续抑制Sn Cs数量。流式细胞检测提示ABT263处理3天后细胞凋亡比例增加,western blot显示c-Caspase3蛋白表达上升,提示ABT263通过c Casp3信号通路介导衰老软骨细胞凋亡。二维培养下,SASP的表达可在没有ABT263的一周后持续受到抑制。免疫组化染色结果显示ATB263可显著减少OA软骨细胞三维培养中的SASP蛋白表达,q PCR及western blot定量检测结果与上述免疫组化染色结果一致,提示ABT263通过促进衰老软骨细胞凋亡能在一定程度上改善OA炎性微环境。4、ABT263有利于维持monolayer culture及pellet culture中的软骨细胞表型Monolayer culture下,q PCR及western blot结果提示ACAN在第10天的m RNA及蛋白表达均有显著增加,提示软骨基质中蛋白多糖合成显著增强。对于pellet culture,番红O染色结果提示OA软骨细胞及HBMSC中蛋白多糖合成增加,western blot结果显示COLII及ACAN蛋白表达显著增加,提示三维培养下的软骨基质合成增强。第三部分:关节腔注射ABT263削弱DMM大鼠创伤性骨关节炎软骨及软骨下骨破坏并减轻炎症1、关节腔注射ABT263减轻DMM大鼠创伤性OA带来的软骨及软骨下骨损伤H&E和Safranin O/fast green染色结果提示,溶剂注射组中胫骨侧软骨表面磨损较为严重,而ABT263注射组的软骨表面破坏相对较轻,并显示出相对完整的软骨结构,提示关节腔注射ABT263能减轻创伤性骨关节炎带来的软骨破坏。与溶剂注射组相比,ABT263注射组较低的OARSI评分也提示其软骨损伤程度较轻,表明ABT263对创伤性骨关节炎中的软骨具有一定的保护作用。Micro-CT扫描和三维重建结果显示,溶剂注射组软骨下骨结构塌陷,表面粗糙不平,而ABT263注射组的软骨下骨表面相较而言更加光滑平整。2、关节腔注射ABT263减少关节软骨中p16阳性Sn Cs数量并减轻炎症免疫组化结果提示p16阳性Sn Cs数量有所下降,HMGB1在软骨细胞中表达升高,同时MMP13表达减弱。q PCR定量分析结果提示p16、p21、IL1β、IL6、MMP13及ADAMTS5表达显著下调,同时COLII和ACAN表达上升,提示大鼠膝关节软骨中炎症反应减轻,软骨基质分解代谢作用减弱。结论和意义:基于上述研究结果可得出以下结论:1、人OA软骨组织及原代OA软骨细胞中存在一定比例的Sn Cs;2、适宜浓度的ABT263可有效清除衰老软骨细胞而不影响正常软骨细胞活性;3、ABT263通过Caspase3信号通路诱导衰老软骨细胞凋亡从而改善OA软骨细胞炎性微环境,并有助于维持软骨表型;4、关节腔注射ABT263对创伤性OA中的软骨及软骨下骨具有一定的保护作用,同时减轻关节腔炎症水平,抑制软骨分解代谢,促进软骨基质的合成。意义:本研究为临床治疗OA提供了新的思路,证明了通过小分子药物靶向清除衰老细胞可能作为一种从发病源头上延缓OA进展的手段。另外,本研究开辟了小分子药物ABT263的新的应用领域,为该类药物治疗OA提供了研究理论基础,揭示了OA作为小分子药物ABT263的新适应症的一种潜在可能性。