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人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是一种感染人类免疫系统的病毒,可通过破环人的淋巴细胞影响细胞免疫和体液免疫过程,导致免疫系统瘫痪,对人类健康存在极大威胁。最新的研究结果表明,CCR5受体是HIV进入T细胞的共受体,因此破坏基因组中的CCR5基因或阻止CCR5基因表达成了阻断HIV侵染人类T细胞的一种新途径。本文运用Ni磁珠与Co磁珠亲和层析技术纯化出超正电荷ZFN融合蛋白,验证出该蛋白具有切割CCR5基因的活性,从而为后续阻断HIV进入T细胞以及HIV基因治疗提供了新思路。本文主要研究结果如下:1.超正电荷ZFN融合蛋白的表达运用IPTG对转化了p ET22b-(+)36GFP/ZFNL和p ET22b-(+)36YFP/ZFNR质粒的两种菌株进行诱导,然后分别在不同温度和不同IPTG浓度的条件下过夜培养,次日分别收集菌体进行超声破碎,SDS-PAGE检测蛋白分布情况。实验结果确定16℃,0.5m M IPTG诱导是融合蛋白(+)36GFP/ZFNL和(+)36YFP/ZFNR表达的最适条件。2.超正电荷ZFN融合蛋白纯化条件的摸索1)通过Ni磁珠亲和层析技术纯化+36GFP/ZFNL融合蛋白,发现高盐裂解液条件有利于此融合蛋白挂柱,后续洗脱可以有效获得该融合蛋白。2)+36YFP/ZFNR融合蛋白同样在高盐裂解液条件下有利于其挂柱,但后续洗脱困难,推测该融合蛋白与Ni磁珠结合过于牢固。然后运用了Co磁珠和已使用两次的Ni磁珠对该融合蛋白进行纯化,发现该方法可以有效获得+36YFP/ZFNR融合蛋白。3.重组质粒Pet22b/CCR5的构建以HCC1954细胞中的基因组DNA作为PCR扩增模板,有效获得人CCR5基因。随后将CCR5目的基因连接到质粒载体Pet22b,经菌落PCR,双酶切及基因测序等方法验证了CCR5基因无突变。4.超正电荷ZFN融合蛋白活性检测将重组质粒p ET22b/CCR5与上述纯化的两个超正电荷ZFN融合蛋白在37℃共孵育1h后,1%琼脂糖凝胶电泳检测,发现随着超正电荷ZFN融合蛋白摩尔量的增加,重组质粒p ET22b/CCR5被切割成线性质粒产物的量也在增加,表明ZFN蛋白活性功能在增强。同时,发现当超正电荷ZFN融合蛋白摩尔量增加到7n M后,该蛋白会对重组质粒p ET22b/CCR5产生非特异性切割。综上所述,我们在大肠杆菌中成功表达了超正电荷ZFN融合蛋白(+)36GFP/ZFNL和(+)36YFP/ZFNR,并利用Ni亲和层析技术对上述两种融合蛋白进行了纯化。在此基础上,本文还构建了重组质粒Pet22b/CCR5,验证了这一对超正电荷ZFN融合蛋白对靶基因的体外切割活性即ZFN融合蛋白对基因组DNA的编辑功能。本文为研究超正电荷ZFN融合蛋白在体内的活性奠定了坚实的理论基础,也为HIV基因治疗方法提供了新思路。