论文部分内容阅读
目的检测人皮肤鳞癌细胞系SCC13细胞表达高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)水平;探讨HMGB1在体外条件下对SCC13细胞迁移能力的影响;探讨HMGB1对SCC13细胞MAPK及PI3K/AKT信号通路的作用,进而探讨HMGB1诱导SCC13细胞迁移过程中的作用机制,对寻找抑制皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC)转移的药物具有重要的意义。方法1、常规体外培养SCC13细胞和A431细胞,通过Western Blot试验及酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析比较SCC13细胞和A431细胞上清液中HMGB1水平差异;2、运用Transwell趋化实验检测不同浓度HMGB1、不同处理时间条件下对SCC13细胞体外迁移能力的影响:(1)在不同处理时间(3h、6h、12h)下运用相同浓度HMGB1(100ng/ml)处理SCC13细胞,结晶紫染色后于显微镜下拍照,统计聚碳酸酯膜下层的细胞数,每个样本随机计数5个视野(200×),取平均值;(2)设不含HMGB1的DMEM液为空白组,在相同处理时间(12h)下运用不同浓度HMGB1(10ng/ml、30ng/ml和100ng/ml)处理SCC13细胞,同样方法计数细胞。每个实验组重复3次。3、Western Blot检测MAPK及PI3K/AKT信号通路相关蛋白:P-p42/44 MAPK和P-p38MAPK,P-AKT和P-p85 PI3K表达差异。设置实验分组:(1)空白组:常规体外培养SCC13细胞;(2)实验组:用100ng/ml HMGB处理SCC13细胞24h;(3)对照组:用HMGB1拮抗剂甘草酸(Glycyrrhizin,GR)100μM处理SCC13细胞24h;(4)对照组:HMGB1和GR共同处理SCC13细胞24h。结果1、SCC13细胞上清液中HMGB1水平显著高于A431细胞。运用Western Blot和ELISA两种方法同时检测两细胞上清液中HMGB1表达水平,两种实验方法结果一致:Western Blot:SCC13细胞HMGB1相对表达水平(4.8)高于A431细胞(1.2),差异有统计学意义(P<0.01);ELISA:SCC13细胞HMGB1表达水平(483ng/ml)同样显著高于A431细胞(99ng/ml),差异具有统计学意义(P<0.001)。2、不同处理时间条件下(3h、6h、12h),相同浓度HMGB1(100ng/ml)促进SCC13细胞的迁移能力水平随时间递增,并且在12h达到峰值,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.0001);相同处理时间(12h)下运用不同浓度HMGB1(10ng/ml、30ng/ml和100ng/ml)处理SCC13细胞,迁移细胞数量随时间递增,且在100ng/ml达到峰值,与空白对照组对比具有显著的差异(P<0.0001)。3、与空白对照组和抑制剂组相比,实验组细胞MAPK及PI3K/AKT信号通路中P-p42/44 MAPK和P-p38 MAPK,P-AKT和P-p85 PI3K等蛋白的表达水平显著升高,HMGB1能活化MAPK及PI3K/AKT信号通路,进而促进SCC13细胞的迁移。结论:1、SCC13细胞的HMGB1分泌水平显著高于A431细胞。2、HMGB1对SCC13细胞的迁移能力有促进作用,并且该作用具有时间-剂量依赖性效应。3、HMGB1能够通过上调MAPK信号通路中P38和P42/44 MAPK蛋白、PI3K/AKT信号通路中AKT和PI3K蛋白的磷酸化水平进而活化MAPK及PI3K/AKT信号通路,从而促进SCC13细胞的迁移。HMGB1有望成为抑制皮肤鳞状细胞癌转移的治疗靶点。