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四氢异喹啉家族化合物的化学结构复杂独特，抗肿瘤及抗菌生物活性显著，特别是海洋来源的ET-743，已于2007年在欧洲批准上市成药。虽然其家族化合物的化学全合成及药物半合成研究已有很多报道，但是对于它们的生物合成机制的精细阐述依然是化学及生物学领域研究的热点。本论文在本课题组前人工作的基础上，深入研究喹诺卡星和番红霉素A生物合成中几个尚未解决的问题，主要包括:(1)番红霉素A生物合成中与脱氨修饰相关的蛋白的发现及其功能研究;(2)喹诺卡星分子结构中特殊的二碳单元的生物来源与合成机制研究;(3)喹诺卡星生物合成基因簇中部分基因的功能研究。 在番红霉素A生物合成中后修饰蛋白的研究中，发现了负责催化脱氨修饰的氧化还原酶SfmCy2。在获得SfmCy2重组蛋白的基础上通过体外生化实验证实了SfmCy2可以催化Safracins及Saframycin Y3分子中的丙氨酰边链氧化脱除氨基成酮;H218O同位素标记实验表明脱氨反应中新形成的羰基氧来源于H2O;点突变实验表明SfmCy2中的His100、Cys155、Tyr461及Glu482等保守氨基酸残基对于SfmCy2的催化功能至关重要;由此提出脱氨反应过程中涉及氢负离子传递的催化机制，可能经历以下三个步骤:首先与SfmCy2共价结合的辅因子FAD氧化分子中裸露的-NH2使其变为活泼的亚胺鎓离子中间体，随后接受H2O的亲核进攻形成不稳定的半缩醛胺，最后释放NH3形成酮。SfmCy2酶功能的鉴定不仅揭示了复杂天然产物的生物合成中一种全新的胞外脱氨机制，而且拓宽了人们对FAD依赖的氧化还原酶功能的认识。 在喹诺卡星二碳单元的生物来源及生物合成机制的研究中，分离纯化了与二碳单位生物合成密切相关的蛋白QncM及QncN/L，通过体外生化实验证实QncN/L催化羟基乙酰二碳单元从供体底物转移到QncM的活化形式Holo-ACP上;另外，在点突变实验中识别了QncN/L中与催化功能密切相关的氨基酸残基QncN中的His245、QncL中的His134及Lys416;底物拓展实验确证二碳单元来源于磷酸酮糖，而且动力学实验表明X-5-P是QncN/L的最适底物。由此，提出了二碳单元的生物合成机制:丙酮酸脱氢酶及转酮醇酶的复合体QncN/L及酰基载体蛋白QncM催化来源于磷酸酮糖的羟基乙酰二碳单元作为NRPS延伸模块参与到喹诺卡星的生物合成中。而萘啶霉素与ET-743分子中二碳单元的生物合成也可能采取类似的机制。这一发现不仅丰富了NRPS合成砌块的结构多样性，还为四氢异喹啉家族化合物的组合生物合成提供了新的工具。 在喹诺卡星基因簇中剩余基因的功能研究中，通过对调控基因的同框缺失及回补实验，证实了qncR3和qncR5是正调控子基因，而qncR4是负调控子基因;进一步将qncR3或qncR5回补到野生型中，使其过量表达，发酵检测发现喹诺卡星产量提高了约8倍，而将qncR3和qncR5共同回补到缺失qncR4拘突变株中，喹诺卡星的产量提高了约16倍。这一结果不仅对我们提高喹诺卡星的产量提供了重要参考，也为我们进一步研究其生物合成机制奠定了良好基础。另外，我们还通过一些体内基因缺失和体外生化实验，初步探索了负责分子核心骨架合成和前体修饰相关蛋白的功能。